背景[1-3]
昆蟲卵巢細(xì)胞該細(xì)胞系源于雌性昆蟲的卵巢組織，可以用于復(fù)制桿狀病毒表達(dá)載體，細(xì)胞不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌。
昆蟲卵巢細(xì)胞
培養(yǎng)步驟
一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：
1）準(zhǔn)備基礎(chǔ)培養(yǎng)基(GIBCO，，添加NaHCO3 1.5g/L，丙酮酸鈉0.11g/L)；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%。
2）培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3）凍存液：90%完全培養(yǎng)基，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。液氮儲(chǔ)存。
二．細(xì)胞處理：
1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2）昆蟲卵巢細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。
2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3.按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3）細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。貼壁細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后加入少量胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，加入約1ml含血清的培養(yǎng)基后加入凍存管中，再添加10%DMSO后進(jìn)行凍存。
應(yīng)用[4][5]
用于基于微流控芯片的東亞飛蝗卵巢細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)研究
東亞飛蝗（Locusta migratoria manilensis Meyen）是危害嚴(yán)重的農(nóng)業(yè)害蟲之一,同時(shí)也是良好的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?但其細(xì)胞學(xué)研究卻相對(duì)缺乏。
選取東亞飛蝗進(jìn)行其卵巢細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)研究,再結(jié)合微流控芯片技術(shù),設(shè)計(jì)了一種可用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的微流控芯片,開展基于微流控芯片的東亞飛蝗卵巢細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)研究。
主要研究結(jié)果如下:1、東亞飛蝗卵巢細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)的建立。利用傳統(tǒng)培養(yǎng)平臺(tái),通過(guò)對(duì)東亞飛蝗卵巢細(xì)胞原代培養(yǎng)條件進(jìn)行研究,得到適宜的培養(yǎng)方法:東亞飛蝗體表用75%乙醇消毒50 min,無(wú)菌解剖出的卵巢組織再次選用75%乙醇消毒5 min。卵巢組織直接剪碎成組織塊培養(yǎng)于培養(yǎng)瓶中,接種時(shí)培養(yǎng)基添加量為0.5 ml,后續(xù)培養(yǎng)逐漸補(bǔ)充培養(yǎng)基。培養(yǎng)基選用L-15作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基并添加10%胎牛血清。結(jié)果表明東亞飛蝗卵巢細(xì)胞在培養(yǎng)3d左右開始有組織塊貼壁生長(zhǎng),5d左右可觀察到從組織周圍遷移出形態(tài)各異的細(xì)胞,16d左右組織或細(xì)胞貼壁緊密并開始相互連接,拉網(wǎng)生長(zhǎng)。
2、微流控芯片的設(shè)計(jì)、加工及測(cè)試。使用SolidWorks軟件進(jìn)行微流控芯片設(shè)計(jì)和三維建模,并對(duì)芯片進(jìn)行流體力學(xué)仿真及加工工藝的優(yōu)化,最后利用人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SH-SY5Y評(píng)價(jià)微流控芯片的細(xì)胞培養(yǎng)效果。結(jié)果顯示,選用PMMA及PS作為微流控芯片的制備材料,8mm適宜作為芯片腔室的厚度,芯片加工方式適宜通過(guò)在180℃下熱壓鍵合20min及環(huán)氧樹脂灌封膠粘合來(lái)完成。SH-SY5Y細(xì)胞成功培養(yǎng)于微流控芯片中,細(xì)胞形態(tài)正常,可持續(xù)增殖,且未發(fā)生微生物污染問(wèn)題,說(shuō)明本文設(shè)計(jì)的微流控芯片可滿足動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)需求。
3、基于微流控芯片的東亞飛蝗卵巢細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。在上述培養(yǎng)技術(shù)及芯片設(shè)計(jì)加工的基礎(chǔ)上,開展了基于微流控芯片的東亞飛蝗卵巢細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)研究。結(jié)果顯示卵巢細(xì)胞在芯片中培養(yǎng)至8d左右可觀察到組織塊貼壁,在適宜的條件下,目前東亞飛蝗卵巢細(xì)胞在微流控芯片的生長(zhǎng)時(shí)間可達(dá)30天以上。
參考文獻(xiàn)
[1]An impedance-coupled microfluidic device for single-cell analysis of primary cell wall regeneration[J].Lincai Chen,Ziyu Han,Xintong Fan,Shuaihua Zhang,Jiehua Wang,Xuexin Duan.Biosensors and Bioelectronics.2020(prep)
[2]Modeling neural tube development by differentiation of human embryonic stem cells in a microfluidic WNT gradient.[J].Rifes Pedro,Isaksson Marc,Rathore Gaurav Singh,Aldrin-Kirk Patrick,M?ller Oliver Knights,Barzaghi Guido,Lee Julie,Egerod Kristoffer Lihme,Rausch Dylan M,Parmar Malin,Pers Tune H,Laurell Thomas,Kirkeby Agnete.Nature biotechnology.2020(11)
[3]Localized microinjection of intact Drosophila melanogaster larva to investigate the effect of serotonin on heart rate[J].Alireza Zabihihesari,Arthur J.Hilliker,Pouya Rezai.Lab on a Chip.2019(2)
[4]Invertebrate Retinal Progenitors as Regenerative Models in a Microfluidic System[J].Caroline D.Pena,Stephanie Zhang,Robert Majeska,Tadmiri Venkatesh,Maribel Vazquez,Yunqing（Kevin）Kang.Cells.2019(10)
[5]歐英琪.基于微流控芯片的東亞飛蝗卵巢細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)研究[D].中央民族大學(xué),2021.