背景[1-3]
非洲綠猴SV40轉(zhuǎn)化的腎細(xì)胞（COS-1）源自CV-1細(xì)胞，經(jīng)帶有編碼野生型T抗原的起始失活突變的SV40轉(zhuǎn)染得到的成纖維細(xì)胞樣貼壁細(xì)胞。COS-1細(xì)胞含有一個(gè)來自SV40基因組全部早期區(qū)域的組成型拷貝，EBNA呈陰性，F(xiàn)c受體呈陰性，補(bǔ)體受體呈陰性。培養(yǎng)條件：DMEM，10%FBS；空氣95%，二氧化碳5%；37℃培養(yǎng)。
非洲綠猴SV40轉(zhuǎn)化的腎細(xì)胞（COS-1）
使用方法:
1.取出25cm2培養(yǎng)瓶,75%酒精消毒,拆下封口膜,放入37℃,5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置6-8小時(shí)或者過夜,以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)。
2.待細(xì)胞達(dá)到80%匯合時(shí)準(zhǔn)備進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
3.細(xì)胞傳代
1)吸出25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基,用PBS清洗細(xì)胞一次;
2)添加0.125%胰蛋白酶消化液約1mL至培養(yǎng)瓶中,37℃溫浴3min左右;倒置顯微鏡下觀察,待細(xì)胞回縮變圓后吸棄消化液,再加入完全培養(yǎng)液終止消化;
3)用吸管輕輕吹打混勻,按1:2或1:3等適當(dāng)?shù)谋壤M(jìn)行接種傳代,然后補(bǔ)充新鮮的完全培養(yǎng)基至5mL,放入37℃,5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng);
4)待細(xì)胞完全貼壁后,培養(yǎng)觀察。之后每隔2-3天更換新鮮的完全培養(yǎng)基。
應(yīng)用[4][5]
用于hBD1穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的建立及其表達(dá)產(chǎn)物對(duì)多重耐藥菌的活性檢測(cè)研究
構(gòu)建人β防御素-1（hBD-1）穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株,并檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物人p防御素-1對(duì)多種多重耐藥菌的抗菌活性。
方法：將重組質(zhì)粒pCMV-hBDl通過陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染于非洲綠猴SV40轉(zhuǎn)化的腎細(xì)胞（COS-7細(xì)胞）,經(jīng)過G418壓力篩選后獲得單克隆細(xì)胞株；提取細(xì)胞總RNA,RT-PCR檢測(cè)目的基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)；收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液,Western blotting檢測(cè)hBDl基因蛋白的表達(dá)；將含有表達(dá)產(chǎn)物hBDl的細(xì)胞培養(yǎng)上清液分別同各耐藥菌液混合,37℃孵育不同時(shí)間后涂布于LB平板,以各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的菌落數(shù)的比值作為該耐藥菌的存活率。
結(jié)果：1.經(jīng)過G418壓力篩選所得到的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株,在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平均檢測(cè)到目的基因hBDl的表達(dá),成功獲得人p防御素-1（hBD-1）穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株；
2. 當(dāng)耐藥菌菌液濃度為2×104個(gè)/m1時(shí),在表達(dá)產(chǎn)物hBD1的作用下,多重耐藥鮑氏不動(dòng)桿菌、多重耐藥大腸埃希菌和多重耐藥肺炎克雷伯桿菌的存活率可以分別降至9%、22%和50%；
3. 當(dāng)耐藥菌菌液濃度為1×104個(gè)/ml時(shí),在表達(dá)產(chǎn)物hBD1的作用下,多重耐藥鮑氏不動(dòng)桿菌、多重耐藥大腸埃希菌和多重耐藥肺炎克雷伯桿菌的存活率可以分別降至12%、19%和46%；
4. 多重耐藥嗜麥芽窄食單胞菌在表達(dá)產(chǎn)物hBD1的作用下,其存活率同對(duì)照組沒有明顯差異。
結(jié)論：成功建立hBDl穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株,目的基因hBD1的表達(dá)產(chǎn)物對(duì)多重耐藥鮑氏不動(dòng)桿菌、多重耐藥大腸埃希菌和多重耐藥肺炎克雷伯桿菌均具有抗菌活性。目的研究0-膽甾醇基殼聚糖（O-CHCS）作為基因載體進(jìn)行人β防御素-2（hBD2）基因轉(zhuǎn)染小鼠纖維母細(xì)胞（L929）的可行性及檢測(cè)目的基因表達(dá)產(chǎn)物的生物活性。方法構(gòu)建重組質(zhì)粒pCMV-hBD2,通過O-CHCS介導(dǎo)轉(zhuǎn)染于L929細(xì)胞,提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞總RNA,用RT-PCR檢測(cè)hBD2基因轉(zhuǎn)錄水平；收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清液,用Western blotting檢測(cè)hBD2基因蛋白的表達(dá)；用Kirby-Bauer紙片法檢測(cè)hBD2抗菌活性,同時(shí)以Lipofect脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑作為陽(yáng)性對(duì)照。
結(jié)果經(jīng)過O-CHCS介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的L929細(xì)胞,目的基因hBD2在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平均有表達(dá),轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清液對(duì)金黃色葡萄球菌有抑菌圈形成,結(jié)果同Lipofect的轉(zhuǎn)染效果基本一致。結(jié)論成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體pCMV-hBD2,證實(shí)了O-CHCS可以作為基因載體用于目的基因（hBD2）的轉(zhuǎn)染,且目的基因表達(dá)產(chǎn)物具有生物活性,為基因工程合成hBD2提供一種經(jīng)濟(jì)便捷的途徑。
參考文獻(xiàn)
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[5]崔南.hBD1穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的建立及其表達(dá)產(chǎn)物對(duì)多重耐藥菌的活性檢測(cè)[D].蘭州大學(xué),2012.