背景^[1-3]

辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記親和純化山羊抗兔IGG可以在Western檢測(cè)時(shí)催化ECL類試劑(如ECL、BeyoECL等)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，可以在ELISA時(shí)催化TMB產(chǎn)生藍(lán)色，也可以在IHC或Western blot檢測(cè)時(shí)催化DAB產(chǎn)生棕色沉淀。

反應(yīng)性該山羊抗兔二抗與兔IgG分子有特異性反應(yīng)，與其它兔免疫球蛋白（包括IgM、IgE、IgD、IgA等）的輕鏈有交叉反應(yīng)。該二抗與血清內(nèi)非免疫球蛋白無交叉反應(yīng)，但可能與其它種屬的免疫球蛋白有交叉反應(yīng)。

辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記親和純化山羊抗兔IGG

HRP（Horseradish Peroxidase，辣根過氧化物酶）是一種分子量達(dá)44000的糖蛋白，由無色的酶蛋白和深棕色的鐵卟啉結(jié)合而成，通常來源于辣根植物中，是臨床檢驗(yàn)試劑中的常用酶。辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）比活性高，穩(wěn)定，分子量小，純酶容易制備，所以最常用。

HRP廣泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由無色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉結(jié)合而成的糖蛋白，糖含量18%。由于其易于提取、價(jià)格相對(duì)低廉，同時(shí)性質(zhì)穩(wěn)定，耐熱及有機(jī)溶劑的作用，與抗原或抗體偶聯(lián)后，活性很少受損失，因此是迄今為止在免疫學(xué)中應(yīng)用最為廣泛的一種標(biāo)記用酶。HRP的催化底物包括色原底物、化學(xué)發(fā)光底物等，其中最常用的色原底物有鄰苯二胺（OPD）、2，2’-吖嗪-（3-乙酰苯基噻唑磺酸-6）（ABTS）、四甲基聯(lián)苯胺（TMB）和4-氨基安替比林:苯酚耦聯(lián)底物對(duì)等；而化學(xué)發(fā)光底物則包括Luminol/增強(qiáng)劑等系統(tǒng)。

應(yīng)用^[4][5]

用于氨芐青霉素殘留ELISA檢測(cè)方法的建立及檢測(cè)條件優(yōu)化研究

本研究制備了氨芐青霉素的多克隆抗體，建立了氨芐青霉素免疫檢測(cè)技術(shù)。通過比較兩種合成方法偶聯(lián)的氨芐青霉素和BSA免疫抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體的親和性和效價(jià)，比較了兩種合成方法的優(yōu)劣。同時(shí)，對(duì)ELISA檢測(cè)條件進(jìn)行了優(yōu)化，建立氨芐青霉素ELISA檢測(cè)技術(shù)。

結(jié)果如下：1通過兩種方法——物理直接偶聯(lián)和以戊二醛為連接物合成了氨芐青霉素和大分子蛋白質(zhì)的免疫抗原和包被抗原并用紫外光譜掃描和紅外吸收光譜掃描的方法對(duì)合成物質(zhì)進(jìn)行了鑒定。

2將合成的氨芐青霉素免疫抗原與等量佐劑混合后多途徑多次免疫兔子，第七次免疫后心臟采血，分離獲得血清，并將這些血清分成3部分進(jìn)行處理：一部分直接冷凍于-20℃，一部分與等量甘油混合后保藏于-20℃冰箱，另一部分血清純化分離IgG、冷凍干燥后保存于-20℃冰箱。

3用瓊擴(kuò)實(shí)驗(yàn)對(duì)抗血清進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)抗血清能與免疫抗原產(chǎn)生沉淀線，而不能與以O(shè)VA作載體蛋白的檢測(cè)抗原產(chǎn)生沉淀線。這說明瓊擴(kuò)實(shí)驗(yàn)是一種很粗略的檢測(cè)方法，能檢測(cè)出血清中大量存在的載體蛋白抗體，半抗原的抗體因?yàn)榱可俨荒茉诃倲U(kuò)實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生沉淀線而被檢測(cè)出來。

4對(duì)ELISA檢測(cè)中所用的HRP酶標(biāo)山羊抗兔IgG的使用濃度和包被抗原類型及其濃度進(jìn)行確定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，酶標(biāo)二抗的使用濃度是1600倍稀釋。由于HSA和BSA有很大同源性，以其為載體蛋白的合成抗原不能作為檢測(cè)抗原。同時(shí)，抗血清中存在抗橋抗體，用于檢測(cè)的包被抗原和免疫抗原由兩種合成方法含成，以消除抗橋抗體的影響。

56只兔子產(chǎn)生的抗血清的效價(jià)分別為：1號(hào)抗血清和2號(hào)抗血清的效價(jià)均是64×103，3號(hào)抗血清的效價(jià)是1×103，4號(hào)抗血清的效價(jià)是8×103，5號(hào)抗血清的效價(jià)是128×103，6號(hào)抗血清的效價(jià)是4×103。其中1、2、5號(hào)兔子產(chǎn)生的抗浙江大學(xué)碩士論文血清的效價(jià)都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于3、4、6號(hào)兔子產(chǎn)生的抗血清。而1、2、5號(hào)兔子都是以Agl作為免疫抗原，3、4、6號(hào)兔子的免疫抗原都是Ag4。這說明不同合成方法合成的免疫抗原有不同的免疫原性。‘對(duì)間接ELISA檢測(cè)條件進(jìn)行優(yōu)化，包括底物溶液的組成、包被液的選擇、包被時(shí)間和溫度的選擇、封閉液的選擇、兔子抗血清的溫育時(shí)間、HR衛(wèi)酶標(biāo)羊抗兔lgG抗體的溫育時(shí)間及底物加樣后溫育時(shí)間，并用L二（56）正交表對(duì)后6個(gè)因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

加好包被液的酶標(biāo)板37℃溫育2h后轉(zhuǎn)入4℃冰箱溫育14h包被。然后以5%甘氨酸封閉醉標(biāo)板。一抗的溫育時(shí)間是1 00min，二抗的溫育時(shí)間是120min，加底物顯色1 smin產(chǎn)生的陰陽性抗血清的OD月5。差值。包被液的類型對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，其次是封閉液的類型和底物作用時(shí)間。由于二抗的溫育時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果影響不是很主要，而且二抗溫育40min和溫育1 00min產(chǎn)生的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相差很少。從節(jié)約時(shí)間和成本的角度出發(fā)，在不降低實(shí)驗(yàn)靈敏度的前提下，二抗的握育時(shí)間定為40min。

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