基因敲除小鼠已經(jīng)成為現(xiàn)代生命科學(xué)基礎(chǔ)研究和藥物研發(fā)領(lǐng)域不可或缺的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，在生命科學(xué)、人類醫(yī)藥和健康研究領(lǐng)域中發(fā)揮著重要的作用?；谂咛ジ杉?xì)胞的基因打靶技術(shù)、EGE技術(shù)（基于Crispr cas9技術(shù)）是當(dāng)下比較火熱的基因敲除小鼠制備技術(shù)。利用這兩種技術(shù)制備基因敲除小鼠的流程是什么樣的？

一、基于胚胎干細(xì)胞的基因打靶技術(shù)制備基因敲除小鼠的流程：

1、課題設(shè)計(jì)，訂購(gòu)課題BAC菌；

2、按照課題設(shè)計(jì)，完成打靶載體設(shè)計(jì)和構(gòu)建；

3、將重組載體電轉(zhuǎn)到胚胎干細(xì)胞中，用G418篩選轉(zhuǎn)染后的胚胎干細(xì)胞，得到陽(yáng)性克??；

4、進(jìn)一步通過PCR和southern blot雜交技術(shù)（基因敲除小鼠檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)）對(duì)上一步得到的陽(yáng)性克隆進(jìn)行篩選，得到穩(wěn)定整合外源基因的胚胎干細(xì)胞陽(yáng)性克??；

5、將胚胎干細(xì)胞陽(yáng)性克隆注射到小鼠囊胚中，并植入到假孕小鼠的子宮內(nèi)；

6、得到嵌合鼠，并獲得F1陽(yáng)性雜合子小鼠。

基于胚胎干細(xì)胞的基因打靶技術(shù)制備基因敲除小鼠是目前為止唯一一個(gè)可以滿足幾乎所有基因組修飾要求的打靶技術(shù)，但目前只應(yīng)用在小鼠的基因敲除上，而且其周期長(zhǎng)工作量大。

二、利用EGE技術(shù)（基于Crispr cas9技術(shù)）制備基因敲除小鼠的流程：

設(shè)計(jì)構(gòu)建識(shí)別靶序列的sgRNA;

設(shè)計(jì)構(gòu)建致靶基因切割的EGE系統(tǒng)載體質(zhì)粒；

利用百奧賽圖自主開發(fā)的UCA試劑盒對(duì)sgRNA/Cas9進(jìn)行活性檢測(cè)；

設(shè)計(jì)構(gòu)建打靶載體；

體外轉(zhuǎn)錄sgRNA/Cas9 mRNA;

小鼠受精卵原核注射sgRNA/Cas9 mRNA和打靶載體；

獲得Fo代小鼠，利用PCR對(duì)Fo代小鼠進(jìn)行基因型鑒定；

獲得F1代小鼠，利用PCR和southernblot雜交技術(shù)（基因敲除小鼠檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)）對(duì)F1代小鼠進(jìn)行基因型鑒定。

雖然EGE技術(shù)（基于Crispr cas9技術(shù)）制備基因敲除小鼠看似比基于胚胎干細(xì)胞的基因打靶技術(shù)制備基因敲除小鼠流程繁瑣，其實(shí)不然，EGE技術(shù)（基于Crispr cas9技術(shù)）系統(tǒng)構(gòu)建簡(jiǎn)單，基因敲除/敲入效率高，速度快，可實(shí)現(xiàn)多基因、多物種基因敲除/敲入，最快2個(gè)月即可得到F0代陽(yáng)性鼠，5個(gè)月得到F1代雜合子小鼠。