背景^[1-3]

MDCK犬腎細(xì)胞是由S·H·Madin和N·B·Darby在1958年9月從一只外觀正常的成年雌性英國(guó)小獵犬的腎分離得到的；MDCK(NBL-2)細(xì)胞角蛋白免疫過氧化物酶染色呈陽(yáng)性；MDCK(NBL-2)細(xì)胞被用于研究β-粥樣蛋白前體的處理及其蛋白水解產(chǎn)物。

MDCK犬腎細(xì)胞

細(xì)胞培養(yǎng)步驟

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1）準(zhǔn)備RPMI-1640培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；+1%Glutamax+1%Sodium Pyruvate，雙抗，1%。

2）培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

二．細(xì)胞處理：

1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入250px皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

3.按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

4.將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

3）細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。

應(yīng)用^[4][5]

用于H3N2犬流感病毒的HA突變株構(gòu)建及其與偽中間葡萄球菌的體外共感染研究

以A/canine/Jiangsu/06/2010（H3N2）完整的8個(gè)基因片段作為骨架,探討HA L222W和HA R326K位點(diǎn)突變對(duì)CIV傳播和毒力的影響;同時(shí)利用犬流感病毒、偽中間葡萄球菌（Staphylococcus pseudintermedius,Sp）和犬腎細(xì)胞（Madin-Darby canine kidney,MDCK）,建立并優(yōu)化了病毒-細(xì)菌體外細(xì)胞共感染模型,研究CIV的預(yù)感染對(duì)偽中間葡萄球菌繼發(fā)感染的作用。

1 H3N2亞型犬流感病毒HA片段定點(diǎn)突變株的構(gòu)建為了研究H3N2亞型犬流感病毒HA蛋白222位和326位氨基酸在病毒感染中的作用,利用定點(diǎn)突變方法分別構(gòu)建了pBD-HA、pBD-HAL222W、pBD-HAR326K、pBD-HA L222W+R326K重組質(zhì)粒。利用八質(zhì)粒反向遺傳操作系統(tǒng),將A/canine/Jiangsu/06/2010（H3N2）江蘇分離株除HA片段以外的7個(gè)基因片段的重組質(zhì)粒,分別與pBD-HA、pBD-HAL222W、pBD-HAR326K、pBD-HAL222W+R326K重組質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染MDCK和293T細(xì)胞,成功拯救出4株病毒,分別命名為r-06、r-06/L222W、r-06/R326K、r-06/L222W+R326K。4株病毒經(jīng)過連續(xù)8次傳代及基因測(cè)序,確認(rèn)了該4株病毒可以穩(wěn)定遺傳。

2 H3N2亞型犬流感病毒HA片段定點(diǎn)突變株的特性分析為了研究HAL222W、HA R326K位點(diǎn)突變對(duì)于A/canine/Jiangsu/06/2010（H3N2）流感病毒復(fù)制能力和致病性的影響,對(duì)構(gòu)建的犬流感病毒r-06/HA及r-06/HA L222W、r-06/HAR326K、r-06/HAL222W+R326K突變株進(jìn)行體外細(xì)胞感染試驗(yàn)和小鼠體內(nèi)感染試驗(yàn)。蝕斑形成試驗(yàn)和MDCK細(xì)胞上生長(zhǎng)曲線結(jié)果顯示:與r-06/HA相比,3株定點(diǎn)突變病毒的蝕斑更大,出現(xiàn)蝕斑時(shí)間更短并且滴度峰值更高,且引起更多的細(xì)胞凋亡。但是MDBK細(xì)胞上的生長(zhǎng)曲線顯示:在24h時(shí),r-06/HA的病毒滴度顯著高于r-06/HA L222W和r-06/HA L222W+R326K（P<0.001）。小鼠試驗(yàn)結(jié)果顯示:突變株與r-06/HA相比,體重下降更多、肺臟病毒載量更高。但無論是體外還是體內(nèi)試驗(yàn),r-06/HA L222W+R326K的結(jié)果均介于r-06/HA與r-06/HA L222W、r-06/HA R326K之間。雞紅細(xì)胞結(jié)合和釋放試驗(yàn)證實(shí)r-06/HA L222W+R326K影響了HA和NA的平衡。

3 H3N2亞型犬流感病毒與偽中間葡萄球菌對(duì)犬腎細(xì)胞的體外共感染為了研究犬流感病毒與偽中間葡萄球菌對(duì)犬腎細(xì)胞的共感染作用,利用犬流感病毒（CIV）、偽中間葡萄球菌（Sp）和犬腎細(xì)胞（MDCK）,建立并優(yōu)化了病毒-細(xì)菌體外細(xì)胞共感染模型。試驗(yàn)分4組:病毒單獨(dú)感染組（CIV）、細(xì)菌單獨(dú)感染組（Sp）、感染病毒后12h再感染細(xì)菌組（CIV/Sp）及空白對(duì)照組（C）。結(jié)果顯示:病毒感染后24h,CIV/Sp組的細(xì)胞毒性為39.7%,極顯著高于CIV組和Sp組（P<0.001）;CIV/Sp組病毒RNA載量顯著低于CIV組（P<0.001）。細(xì)菌黏附和侵襲試驗(yàn)表明:細(xì)菌感染后4h,CIV/Sp的黏附和侵襲量極顯著高于Sp組（P<0.001）,侵襲量升高20倍。細(xì)菌感染后6h,CIV/Sp組IL-6、TNF-α的表達(dá)量均極顯著高于其他3組（P<0.001）。

參考文獻(xiàn)

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[4]Could A Deletion in Neuraminidase Stalk Strengthen Human Tropism of the Novel Avian Influenza Virus H7N9 in China,2013[J].Chen,Liang,Zhu,Feng,Xiong,Chenglong,Zhang,Zhijie,Jiang,Lufang,Chen,Yue,Zhao,Genming,Jiang,Qingwu.International Journal of Environmental Research and Public Health.2015(1)

[5]梁姍.H3N2犬流感病毒的HA突變株構(gòu)建及其與偽中間葡萄球菌的體外共感染[D].南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2017.