背景[1-3]
蝙蝠肺細(xì)胞分離自蝙蝠肺組織形態(tài)為貼壁生長(zhǎng)。肺是機(jī)體的呼吸器官,位于胸腔,左右各一,覆蓋于心之上。肺有分葉,左二右三,共五葉。肺經(jīng)肺系(指氣管、支氣管等)與喉、鼻相連,故稱(chēng)喉為肺之門(mén)戶,鼻為肺之外竅。肺泡由單層上皮細(xì)胞構(gòu)成的半球狀囊泡。肺中的支氣管經(jīng)多次反復(fù)分枝成無(wú)數(shù)細(xì)支氣管,它們的末端膨大成囊,囊的四周有很多突出的小囊泡,即為肺泡。
蝙蝠肺細(xì)胞
細(xì)胞復(fù)蘇操作步驟:
1.將冷凍管迅速由液氮轉(zhuǎn)入到37℃水浴中,冷凍管的頂部保持在水面以上以避免任何污染,不定時(shí)攪拌加速解凍;
2.當(dāng)細(xì)胞完全解凍后,用含70%乙醇的紗布擦拭冷凍管消毒;
3.將解凍后細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含4℃預(yù)平衡培養(yǎng)液的試管中;
4.細(xì)胞懸液在4℃下200磄離心10分鐘;
5.棄上清,將細(xì)胞重新懸浮在新鮮培養(yǎng)液中;
6.將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)瓶,CO2孵箱中培養(yǎng);
7.是用倒置顯微鏡檢查細(xì)胞存活率以及細(xì)胞密度,如果細(xì)胞密度過(guò)高,用培養(yǎng)液稀釋至適宜濃度。
收到細(xì)胞后,取出培養(yǎng)瓶在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。
(一)如果細(xì)胞未長(zhǎng)滿,用75%酒精噴灑整個(gè)瓶消毒后放到超菌臺(tái)內(nèi),嚴(yán)格無(wú)菌操作,打開(kāi)細(xì)胞培養(yǎng)瓶,吸出培養(yǎng)液,僅留下10ml培養(yǎng)液在瓶?jī)?nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。
(二)如果細(xì)胞已長(zhǎng)滿,即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。具體步驟如下:
1.棄去培養(yǎng)液,用PBS(不含鈣,鎂離子)洗1-2次。
2.加1ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培養(yǎng)瓶中,倒轉(zhuǎn)放于37度培養(yǎng)箱1-3分鐘預(yù)熱,然后又將培養(yǎng)瓶倒轉(zhuǎn)大約30秒后,在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況,若細(xì)胞大部分變圓分散,輕敲幾下培養(yǎng)培養(yǎng)瓶,細(xì)胞隨即脫落下來(lái)。
3.加入6-8ml完全培養(yǎng)基,吸出,分到新的培養(yǎng)瓶中。1:3~1:6傳代;2~3天1次。
應(yīng)用[4][5]
用于蝙蝠葛蘇林堿增效順鉑肺癌化療的效果及機(jī)制研究
研究表明順鉑在治療肺癌過(guò)程中會(huì)誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞產(chǎn)生自噬活性,這是產(chǎn)生順鉑耐藥的關(guān)鍵機(jī)制之一,因此抑制自噬就成為增效順鉑對(duì)肺癌治療效果的有前景的策略之一。
通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)對(duì)中藥小分子蝙蝠葛蘇林堿抑制自噬的效果和機(jī)制以及增效順鉑治療肺癌的效果和機(jī)制進(jìn)行深入的探索和研究。
方法:(1)蝙蝠葛蘇林堿對(duì)肺癌細(xì)胞自噬的影響1、通過(guò)免疫熒光染色標(biāo)記自噬體,檢測(cè)蝙蝠葛蘇林堿作用后肺癌細(xì)胞中自噬體數(shù)量的變化。
2、通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蝙蝠葛蘇林堿作用后肺癌細(xì)胞中自噬相關(guān)指標(biāo)p62和LC3蛋白水平的變化。
3、通過(guò)mCherry-GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蝙蝠葛蘇林堿作用后肺癌細(xì)胞中自噬流的變化。
參考文獻(xiàn)
[1]Long term survival withthoracoscopic versus open lobectomy:propensity matched comparative analysis using SEER-Medicare database.Paul S,Isaacs AJ,Treasure T,Altorki NK,Sedrakyan A.British Medical Journal.2014
[2]Occupational exposure to silica dust and risk of lung cancer:an updated meta-analysis of epidemiological studies.Poinenrughooputh S,Rughooputh MS,Guo Y,et al.BMC Public Health.2016
[3]Global surveillance of trends in cancer survival 2000-14(concord-3):Analysis of individual records for 37513025 patients diagnosed with one of 18 cancers from 322 population-based registries in 71 countries.Allemani,C,Matsuda,T,Di Carlo,V,Harewood,R,Matz,M,Niksic,M,Bonaventure,A,Valkov,M,Johnson,C.J,Esteve,J,Ogunbiyi,O.J,Silva,G.A.E,Chen,W.Q,Eser,S,Engholm,G,Stiller,C.A,Monnereau,A,Woods,R.R,Visser,O,Lim,G.H,Aitken,J,Weir,H.K,Coleman,M.P,Grp,C.W.The Lancet.2018
[4]Enrichr:a comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update.Kuleshov MV,Jones MR,Rouillard AD,et al.Nucleic Acids Research.2016
[5]王坤.蝙蝠葛蘇林堿增效順鉑肺癌化療的效果及機(jī)制研究[D].廣州中醫(yī)藥大學(xué),2020.