背景^[1-3]

多克隆抗體制備服務(wù)是根據(jù)要求制備多克隆抗體的技術(shù)服務(wù)，免疫物種采用SPF級(jí)兔，大鼠，小鼠和豚鼠等?？墒褂眯》肿?、多肽、修飾多肽、蛋白、融合蛋白、修飾蛋白等作為抗原進(jìn)行多克隆抗體制備，制備的多克隆抗體能夠用于Western Blot，ELISA，和IHC等多種應(yīng)用。

原理：當(dāng)機(jī)體受到抗原刺激后,產(chǎn)生免疫學(xué)反應(yīng)，由機(jī)體的漿細(xì)胞合成并分泌的與抗原有特異性結(jié)合能力的一組球蛋白(免疫球蛋白)，這種與抗原有特異性結(jié)合能力的免疫球蛋白就是抗體。抗體的特異性取決于抗原分子的決定簇,各抗原分子具有許多抗原決定簇。因此,由它免疫動(dòng)物所產(chǎn)生的抗血清實(shí)際上是多種抗體的混合物,稱為多克隆抗體。相對于單抗來說，它能識(shí)別多個(gè)抗原表位。由于具有可識(shí)別多個(gè)表位、可引起凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)診斷領(lǐng)域。

多克隆抗體制備

服務(wù)流程：

1.提供抗原，純度需>85%，濃度>0.5 mg/mL，至少1.5 mg；

2.免疫2只FPS動(dòng)物，共進(jìn)行3次免疫；

3.采集1mL免疫前血清，作為陰性對照；

4.采集免疫后2只FPS動(dòng)物的多抗血清，分別進(jìn)行ELISA效價(jià)檢測試驗(yàn)；

5.提供ELISA檢測報(bào)告和1ml免疫前血清。

應(yīng)用^[4][5]

用于人EGFL6的重組表達(dá)，鑒定，純化及多克隆抗體制備研究

通過克隆EGFL6全長及片段基因，構(gòu)建pET32a（+）-EGFL6全長及片段蛋白原核表達(dá)載體，誘導(dǎo)表達(dá)并鑒定全長EGFL6蛋白及片段蛋白，并利用EGFL6片段蛋白免疫制備抗EGFL6多克隆抗體，應(yīng)用其檢測人腫瘤細(xì)胞系中EGFL6全長蛋白，為深入研究EGFL6的相關(guān)功能奠定了基礎(chǔ)。

方法:（1）全長人EGFL6基因的亞克隆與原核表達(dá)：以本實(shí)驗(yàn)室保存的EGFL6載體質(zhì)粒為模板PCR擴(kuò)增EGFL6全長基因，將其連接到pMDTM18-T經(jīng)克隆，測序，酶切鑒定正確后連接至表達(dá)載體pET32a（+）上，轉(zhuǎn)化到克隆菌株以及表達(dá)菌株，同樣通過雙酶切鑒定正確后,進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE及Western blot的方法檢測和鑒定目的蛋白的表達(dá)。

（2）腫瘤細(xì)胞株中EGFL6的表達(dá)檢測，從8株不同腫瘤及正常細(xì)胞系中提取總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測8株細(xì)胞系中EGFL6基因的表達(dá)水平。

（3）腫瘤細(xì)胞株中EGFL6基因片段的克隆與表達(dá)：以表達(dá)水平最高的一株細(xì)胞cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增EGFL6片段基因，將其連接到pMDTM18-T載體上經(jīng)克隆,測序和酶切鑒定正確后連接至表達(dá)載體pET32a（+）上，轉(zhuǎn)化克隆菌株Ecoli.DH5α及表達(dá)菌株E coliRosetta-gami B，同樣通過雙酶切鑒定正確后,進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE及Western blot鑒定目的蛋白的表達(dá)。

（4）EGFL6片段的純化、多克隆抗體的制備與檢測：目標(biāo)蛋白經(jīng)大量表達(dá)后，利用鎳離子親和樹脂進(jìn)行純化EGFL6片段蛋白，以純化產(chǎn)物為完全抗原免疫昆明小鼠制備抗EGFL6的多克隆抗體，該多克隆抗體經(jīng)辛酸-硫酸銨法沉淀后純化后，作為抗體對A375，SKOV3及HUVEC細(xì)胞裂解物進(jìn)行Western blot檢測分析。

參考文獻(xiàn)

[1]High-yield production,purification and characterization of functional human duodenal cytochrome b in an Escherichia coli system[J].Wen Liu,Gang Wu,Ah-Lim Tsai,Richard J.Kulmacz.Protein Expression and Purification.2011(1)

[2]EGFL6 is increasingly expressed in human obesity and promotes proliferation of adipose tissue-derived stromal vascular cells[J].Rupert Oberauer,Wolfgang Rist,Martin C.Lenter,Bradford S.Hamilton,Heike Neubauer.Molecular and Cellular Biochemistry.2010(1)

[3]Epidermal growth factor-like domain 7（EGFL7）modulates Notch signalling and affects neural stem cell renewal.[J].Schmidt Mirko H H,Bicker Frank,Nikolic Iva,Meister Jeannette,Babuke Tanja,Picuric Srdjan,Müller-Esterl Werner,Plate Karl H,Dikic Ivan.Nature cell biology.2009(7)

[4]VE-statin/egfl7 regulates vascular elastogenesis by interacting with lysyl oxidases.[J].Lelièvre Etienne,Hinek Aleksander,Lupu Florea,Buquet Christelle,Soncin Fabrice,Mattot Virginie.The EMBO journal.2008(12)

[5]楊晶.人EGFL6的重組表達(dá)，鑒定，純化及多克隆抗體制備[D].暨南大學(xué),2013.