背景[1-3]
Β淀粉樣前體蛋白裂解酶2抗體是可以特異性結(jié)合Β淀粉樣前體蛋白裂解酶2的一類多克隆抗體,主要用于Β淀粉樣前體蛋白裂解酶2的體外檢測實驗。
淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)是一種廣泛存在于全身組織細(xì)胞上的單次跨膜蛋白,其經(jīng)蛋白酶裂解后會產(chǎn)生具有毒性作用的β-淀粉樣蛋白,迄今為止人們對APP真正的生理功能仍知之甚少。
Β淀粉樣前體蛋白裂解酶2免疫組化圖
淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)是一種廣泛存在于全身組織細(xì)胞上的單次跨膜蛋白,因其經(jīng)蛋白酶裂解后產(chǎn)生具有毒性作用的β-淀粉樣蛋白(β-amyloid,Aβ)而廣受關(guān)注,但迄今為止人們對APP真正的生理功能仍知之甚少,許多學(xué)者認(rèn)為APP裂解后形成的Aβ沉積所形成的老年斑是AD發(fā)病的重要原因。
老年斑的主要成分是39-43氨基酸長的β淀粉樣肽(β-amyloid peptide,Aβ),Aβ由β淀粉樣前體蛋白(β-amyloid precursor protein,APP)水解而來,APP可以被三種水解酶裂解:α-secretase、β-secretase、γ-secretase。α-secretase的水解位點在APP跨膜區(qū)的Aβ區(qū)內(nèi),產(chǎn)生一長的可溶性的胞外結(jié)構(gòu)α-APPs和一83堿基的C末端(COOH-terminal fragment,CTF)——C83,不產(chǎn)生Aβ。
而淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)經(jīng)β淀粉樣前體蛋白裂解酶(β-siteAPP cleaving enzyme,BACE1)和γ-分泌酶裂解產(chǎn)生Aβ。淀粉級聯(lián)學(xué)說認(rèn)為老年斑的核心成分β-淀粉樣肽(β-amyloid peptide,Aβ)是AD發(fā)生的主要原因。BACE1(β-secretase)酶是Aβ形成的關(guān)鍵酶。老年斑或Aβ可以促進(jìn)AD的疾病進(jìn)展,而且是AD臨床表現(xiàn)的關(guān)鍵性因素。
應(yīng)用[4][5]
用于干預(yù)β-淀粉樣前體蛋白裂解酶基因減少神經(jīng)細(xì)胞β淀粉樣蛋白的產(chǎn)生研究
利用干擾技術(shù)應(yīng)用siRNA對BACE1基因進(jìn)行干擾抑制,觀察BACEl基因在SK-N-SH細(xì)胞株中的表達(dá)的改變,以及Aβ產(chǎn)生的改變情況。
1、利用siRNA干擾技術(shù),采用化學(xué)合成的siRNA干擾或封閉BACE1基因,觀察BACE1的表達(dá)改變。2、進(jìn)一步觀察BACE1基因的表達(dá)下降后,對體外培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞Aβ產(chǎn)生的影響。
實驗方法1、人類的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SK-N-SH細(xì)胞正常情況下,表達(dá)APP和BACE1,利用SK-N-SH細(xì)胞作為體外研究的細(xì)胞系。
2、利用Ambion公司的Silencer?pre-designed siRAN Specificationsystem設(shè)計合成了3對BACEl基因雙鏈siRNA。3對siRNAs特異性的針對BACE1基因。
3、利用Ambion公司的siPORT NeoFX轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染siRNA入SK-N-SH細(xì)胞。為比較、觀察siRNA對BACE1基因的干擾作用,分別使用了10μM-50uM濃度不等的siRNA轉(zhuǎn)染SK-N-SH細(xì)胞,并且分別從12-48小時搜集細(xì)胞,進(jìn)行檢測。
4、應(yīng)用RT-PCR在的mRNA水平上檢測BACE1基因的表達(dá)。
5、應(yīng)用Western blot方法,檢測轉(zhuǎn)染48小時后的神經(jīng)細(xì)胞的BACE1蛋白表達(dá)。
6、應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測分泌到細(xì)胞外的Aβ42的量。轉(zhuǎn)染后6小時將siPORT NeoFX轉(zhuǎn)染試劑換成MEM細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)SK-N-SH細(xì)胞,并且每6-12小時收集培養(yǎng)液上清用于檢測Aβ42。
參考文獻(xiàn)
[1]P2-052[J].Juan Manuel Maler,Hans W.Klafki,Hermann Esselmann,Nikolaus Kunz,Sabine Paul,Johannes Kornhuber,Jens Wiltfang.Alzheimer’s&Dementia:The Journal of the Alzheimer’s Association.2006(3)
[2]Twenty Years of the Alzheimer’s Disease Amyloid Hypothesis:A Genetic Perspective[J].Rudolph E.Tanzi,Lars Bertram.Cell.2005(4)
[3]Are mitochondria critical in the pathogenesis of Alzheimer’s disease?[J].P.Hemachandra Reddy,M.Flint Beal.Brain Research Reviews.2005(3)
[4]Role of protein aggregation in mitochondrial dysfunction and neurodegeneration in Alzheimer’s and Parkinson’s diseases[J].Makoto Hashimoto,Edward Rockenstein,Leslie Crews,Eliezer Masliah.NeuroMolecular Medicine.2003(1)
[5]高素琴.干預(yù)β-淀粉樣前體蛋白裂解酶基因減少神經(jīng)細(xì)胞β淀粉樣蛋白的產(chǎn)生[D].山東大學(xué),2009.