背景^[1-3]

考馬斯亮藍染色試劑盒(常規(guī)法)采用了最經(jīng)典的考馬斯亮藍染色和脫色方法，以考馬斯亮藍R250為染料，可用于SDS-PAGE或非變性PAGE等蛋白電泳凝膠的常規(guī)染色和脫色，或Western轉(zhuǎn)膜后PAGE膠上殘余蛋白的檢測。

使用考馬斯亮藍染色試劑盒，采用常規(guī)染色脫色方法累計時間達到2-3小時后可以觀察到蛋白條帶；采用快速染色脫色方法20分鐘左右即可觀察到蛋白條帶。觀察到最清晰的蛋白條帶則需染色脫色更長時間。

考馬斯亮藍染色試劑盒中的染色液和脫色液經(jīng)過改良，不含有毒的甲醇，但含有刺激性氣味的乙酸。

使用方法：

1.電泳結(jié)束后，取凝膠放入適量考馬斯亮藍染色液中，確保染色液可以充分覆蓋凝膠。

2.置于水平搖床或側(cè)擺搖床上緩慢搖動，室溫染色1小時或更長時間。

3.倒出染色液。染色液可以回收重復(fù)使用至少2-3次。

4.加入適量脫色液，確保脫色液可以充分覆蓋凝膠。

5.置于水平搖床或側(cè)擺搖床上緩慢搖動，室溫脫色4-24小時。期間更換脫色液2-4次，直至藍色背景基本上全部被脫去，并且蛋白條帶染色效果達到預(yù)期。通常蛋白條帶在脫色1-2小時后即可出現(xiàn)。

6．完成脫色后，可以把凝膠保存在水中，用于后續(xù)的拍照等。保存在水中的凝膠會發(fā)生溶漲。如需避免溶漲，可以把膠保存在含20%甘油的水中。長期保存可以制備干膠。

應(yīng)用^[4][5]

用于骨炎定對體外培養(yǎng)軟骨細胞的影響研究

采用軟骨細胞培養(yǎng)技術(shù)觀察其對軟骨細胞代謝的影響。

關(guān)節(jié)軟骨細胞的分離和培養(yǎng)采用膠原酶Ⅱ分段酶消化法從三月齡大耳白兔的關(guān)節(jié)軟骨中分離出軟骨細胞并進行原代和傳代培養(yǎng)。每日在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及其生長情況，并用甲苯胺藍異染色法進行細胞表型鑒定。

結(jié)果表明，軟骨細胞形成單層的時間原代培養(yǎng)1周左右，傳代培養(yǎng)約4-5天，細胞以圓形或上皮樣細胞形態(tài)為主。甲苯胺藍染色證實，細胞可合成蛋白多糖，異染反應(yīng)主要集中在細胞集落樣生長區(qū)，異染程度以原代培養(yǎng)最為顯著。

骨炎定對培養(yǎng)兔軟骨細胞增殖和蛋白質(zhì)合成的影響把傳一代的軟骨細胞接種于96孔培養(yǎng)板和24孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24小時后細胞貼壁進行分組試驗。

1 MTT法測細胞增殖把96孔培養(yǎng)板中的32孔隨機分為8組，每組4孔，每孔培養(yǎng)體積0.1ml。A組（對照組）加用5％血清培養(yǎng)液；B-G組：分別加用含有5％血清與1.25％、2.5％、5％、10％、20％、40％DMEM培養(yǎng)液；AO組為空白調(diào)零組，未接種細胞，只加有含有5％血清的DMEM在培養(yǎng)48小時后用MIT ie檢測細胞活性和增殖。結(jié)果GYD組5O、10o、20％骨炎定可促進軟骨細胞增殖，與對照組相比，差別有非常顯著意義。

2考馬斯亮藍祛檢測細胞總蛋白24孔培養(yǎng)板隨機分為六組，每組4孔，分別為：A組：空白對照組。只加含有5％血清培養(yǎng)液；BS組分別加含有20％、10％、5％骨炎定、5％防風(fēng)、5％當歸注射液的培養(yǎng)液，培養(yǎng)三天后用考馬斯亮藍法檢測細胞總蛋白。結(jié)果表明：5％、10％、20％可促進軟骨細胞總蛋白合成，與對照組相比差別有非常顯著性意義。

參考文獻

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[2]Microgravity tissue engineering[J].Lisa E.Freed,Gordana Vunjak-Novakovic.In Vitro Cellular&Developmental Biology-Animal.1997(5)

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