背景及概述^[1]

即T4 DNA連接酶。DNA連接酶（EC6.5.1.1）用于體外DNA連接、連接檢測(cè)PCR，體內(nèi)岡崎片斷連接成完整基因組DNA有重要作用?；蚬こ趟肈NA連接酶由公司提供，最常用的是T4 DNA連接酶（T4Lig）。

連接酶分子大小^[1]

T4 DNA連接酶由T4嗜菌體30基因合成，最早從T4嗜菌體感染的E。coli提取。后來發(fā)現(xiàn)DNA復(fù)制缺失型嗜菌體中連接酶產(chǎn)量更高，從而作為連接酶的主要來源，目前市場(chǎng)供應(yīng)連接酶通過基因工程方法生產(chǎn)。Murry測(cè)定T4 DNA連接酶分子量為63000~68000Da，Armstrong進(jìn)一步確定為55，230Da，由487個(gè)氨基酸（Aa）殘基組成，基因長(zhǎng)度1464bp（GenBank序列號(hào)為X00039）。按照分子量與分子大小比例關(guān)系估算，T4 DNA連接酶大小約3。4nm，可跨越約1個(gè)DNA雙螺旋長(zhǎng)度（即10bp）。連接酶占據(jù)連接端口下游（5’-P端部）7~10bp，占據(jù)端口上游（3’-OH端部）3~5bp。只有487Aa的酶分子同時(shí)具有連接活性，拓?fù)洚悩?gòu)活性表明其結(jié)構(gòu)、功能比較復(fù)雜。與之相比，E.coli DNA連接酶671Aa，分子量74000Da，每個(gè)E.coli細(xì)胞含有約300個(gè)DNA連接酶分子，與DNA聚合酶分子個(gè)數(shù)接近，可以滿足DNA復(fù)制時(shí)岡崎片斷連接需要，細(xì)菌和真核生物中岡崎片斷長(zhǎng)度分別為1000bp左右和100~200bp。

連接酶保真性^[1]

相對(duì)于DNA聚合酶，連接酶保真性不太熟悉，特別是DNA體外連接的科研人員。連接酶保真性是指酶分子識(shí)別連接端口核苷酸的能力。T4 DNA連接酶識(shí)別連接端口堿基能力較低，從而連接多種異常端口：3’或5’無嘌呤或無嘧啶堿基、缺失1nt的連接端口、3’和5’A-A或T-T配對(duì)、5’G-T配對(duì)、3’C-A、C-T、T-G、T-T、T-C、A-C、G-G、G-T配對(duì)。連接反應(yīng)中加入亞精胺（spermidine）、高鹽緩沖液，或降低連接酶用量可以提高T4 DNA連接酶保真性。Wu等發(fā)現(xiàn)100nMDNA在1UT4 DNA連接酶，200mM高鹽濃度下保真性可提高60倍。隨著保真性提高，Km增加4倍，Vmax降低~30倍。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）DNA連接酶保真性較高，可識(shí)別1nt缺失端口和3’A-G或T-G配對(duì)端口，但是識(shí)別5’A-C、T-C、C-A、G-A匹配能力不高。5’-P端部核苷酸識(shí)別能力較低可能與5’-P-AMP復(fù)合物的形成有關(guān)。與常溫作用的T4 DNA連接酶連接酶（37℃）不同，有些高溫作用的DNA連接酶：Pyrococcus furiosus（Pfu）連接酶、Thermus aquaticus（Taq）連接酶、Thermus thermophilus（Tth）連接酶、Thermotoga maritima（Tma）連接酶。Taq DNA連接酶反應(yīng)溫度45~65℃，Tma DNA連接酶反應(yīng)溫度60℃。Taq DNA連接酶保真性比T4 DNA連接酶、E.coli DNA連接酶高很多。TthDNA連接酶保真性比T4 DNA連接酶高24倍。Tth DNA連接酶具有3’-5’外切活性，可以切去與模板非匹配堿基。Tth DNA連接酶的保真性較高，可能與Tth DNA聚合酶3’-5’外切活性較低有關(guān)，高溫菌T.thermophilus DNA合成中很少摻入錯(cuò)配堿基，需要Tth DNA連接酶切去岡崎片斷連接時(shí)錯(cuò)配堿基。TthDNA連接酶中K294R和K294P突變后，既保留了該酶的切口DNA連接活性，又提高了保真性約4倍和11倍。T4 DNA連接酶識(shí)別錯(cuò)配堿基能力較低，可能與T4 DNA連接酶的3’-5’外切活性有關(guān)。

連接機(jī)理與結(jié)構(gòu)^[1]

目前DNA連接反應(yīng)機(jī)理是基于切口雙鏈DNA底物得到的：普遍認(rèn)為連接反應(yīng)由三步完成：①T4 DNA連接酶先由ATP供能產(chǎn)生E-AMP復(fù)合物；②E-AMP復(fù)合物識(shí)別雙鏈DNA切口位置，將AMP轉(zhuǎn)移到5’-P基團(tuán)，形成5’-P-AMP復(fù)合物；③3’-OH親核攻擊5’-P-AMP形成磷酸二酯鍵，并釋放出AMP。在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)（October 2015 Release）檢測(cè)不到T4 DNA連接酶的晶體結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致連接機(jī)理不完全明了，特別是平端DNA連接機(jī)理不完善。以熱穩(wěn)定性Pfu DNA連接酶晶體結(jié)構(gòu)為模板，筆者通過同源分子建模模擬T4 DNA連接酶結(jié)構(gòu)（圖1）。顯示出DNA連接酶有三個(gè)保守性結(jié)構(gòu)域：DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域DBD（DNA-binding domain，M1~L129），腺苷?；Y(jié)構(gòu)域AdD（adenylaition domain，I130~E368），寡核苷酸鏈結(jié)合結(jié)構(gòu)域OBD（oligonucleotide-binding-fold，V369~E482）。腺苷酰化結(jié)構(gòu)域AdD中K159是腺苷?；稽c(diǎn)，通過該位點(diǎn)形成N6-AMP-lysine酶-底物復(fù)合物。根據(jù)相似性比對(duì)發(fā)現(xiàn)，R164、R182、R359、K365是ATP結(jié)合位點(diǎn)，E217、E344二價(jià)金屬離子結(jié)合位點(diǎn)（UniProtKB登錄號(hào)：P00970）。Rossi等切除T4 DNA連接酶N-端80個(gè)Aa、C-端57個(gè)Aa、C-端137個(gè)Aa分別得到NΔ80、C-Δ57、C-Δ137突變體，酶學(xué)性質(zhì)表明N端80個(gè)Aa、C端57個(gè)Aa在DNA結(jié)合中起重要作用。模擬結(jié)構(gòu)顯示N端M1~L129是DBD結(jié)構(gòu)域，C端V369~E482是OBD結(jié)構(gòu)域（圖1），均與DNA結(jié)合有關(guān)。端部切除顯示E-DNA復(fù)合物有兩種狀態(tài)：腺苷?；阜肿訌?fù)合物的短暫態(tài)（T·complex）：是指ATP將AMP轉(zhuǎn)移到連接酶K159上形成E-AMP復(fù)合物；去腺苷?；瘧B(tài)酶分子復(fù)合物的穩(wěn)定態(tài)（S·complex）：是指E-AMP復(fù)合物將AMP轉(zhuǎn)移到連接端口5’-P基團(tuán)形成5’-P-AMP復(fù)合物，需要尋找附近的3-OH，所以此時(shí)E-DNA復(fù)合物是一種穩(wěn)定態(tài)，穩(wěn)定態(tài)復(fù)合物與平端連接有關(guān)。K159是T4 DNA連接酶酶分子腺苷?；饔梦稽c(diǎn)，K159L突變體表明K159不參與識(shí)別DNA、但是K159L突變后酶分子不能完成自身腺苷?；?。在AMP存在下，K159L突變體具有DNA內(nèi)切活性，可以將超螺旋質(zhì)粒DNA切成環(huán)狀切口DNA，解除DNA超螺旋。

平端連接效率^[1]

Sgaramella檢測(cè)到T4 DNA連接酶具有平端連接功能。T4 DNA連接酶以切口雙鏈DNA為底物時(shí)動(dòng)力學(xué)參數(shù)顯示Kcat=0.4s^-1，Kcat/Km=1.5×10⁸M^-1s^-1，以粘性末端、平端DNA為底物時(shí)Km值分別為0。6μM、50μM，表明T4 DNA連接酶對(duì)切口比平端端口DNA親合力高5個(gè)數(shù)量級(jí)，所以平端DNA連接時(shí)需要高出10倍的酶量。在T4RNA連接酶存在時(shí)，T4 DNA連接酶連接平端DNA效率接近于粘性末端DNA。T4 DNA連接酶連接平端DNA效率很低，加入高濃度血清白蛋白、聚乙二醇（PEG：polyethyleneglycol）、Ficoll0、高氯化鈷能提高平端連接效率。PEG存在時(shí)，大鼠肝細(xì)胞核連接酶和E。coli連接酶也能連接平端DNA，發(fā)現(xiàn)加入32%PEG200后E.coli連接酶具有平端連接功能。PEG存在時(shí)，提高溫度有利于分子連接。粘性末端需要堿基間互補(bǔ)匹配的氫鍵作用，16℃過夜連接更有效。平末端不需要?dú)滏I作用，在20℃較高溫度下容易形成磷酸二酯鍵。DNA濃度高于0.3nM容易形成分子間連接、主要用于基因克隆。DNA濃度低于0.3nM時(shí)容易形成分子內(nèi)連接，主要用于質(zhì)粒DNA分子自身環(huán)化，DNA分子內(nèi)平端連接可以高效構(gòu)建重組質(zhì)粒。目前分子內(nèi)連接主要用于突變研究，如Quickchange、TaKaRa Mutan BEST Kit突變、原位易錯(cuò)PCR一步構(gòu)建突變體文庫(kù)等。因?yàn)槠蕉诉B接效率很低，為了將平端轉(zhuǎn)換為粘性末端，在DNA端部引入限制性酶切位點(diǎn)，通過酶切后產(chǎn)生粘性匹配末端以提高連接效率。為了避免限制性酶切效率的限制，通過T載體、PEASY-載體、拓?fù)洚悩?gòu)酶連接載體等粘性連接載體，進(jìn)一步，開發(fā)了無限制性酶切的PCR方法連接載體，利用噬菌體同源重組酶的同源基因克隆方式，Gibson連接方式是利用T5外切酶產(chǎn)生粘性匹配末端，由Phusion DNA聚合酶將缺口補(bǔ)齊，而后由Taq DNA連接酶連接端口。

平端連接反應(yīng)檢測(cè)^[1]

DNA連接需要三個(gè)步驟完成，ATP將AMP轉(zhuǎn)移到酶分子K159上，而后E-AMP復(fù)合物識(shí)別DNA雙鏈切口位置，將AMP轉(zhuǎn)移到端口5’-P形成5’-P-AMP復(fù)合物，在酶分子作用下由3-OH親核攻擊形成磷酸二酯鍵。通過下列幾種方式檢測(cè)連接端口是否形成二酯鍵。1）限制性內(nèi)切酶檢測(cè)：經(jīng)限制性酶切的質(zhì)粒DNA經(jīng)4Lig連接后，能夠用相同的限制性酶切開，說明T4 DNA連接酶將平端DNA連接成雙鏈。2）堿性磷酸酶（alkaline phosphatase）抗性檢測(cè)：堿性磷酸酶能夠從線性DNA端部降解核苷酸，酶連產(chǎn)物如果能抗堿性磷酸酶消化，則表明單個(gè)DNA分子連接成多聚物。電泳可以檢測(cè)DNA單體是否形成了多聚體，但是只能檢測(cè)是否存在多聚體，不能證明是否形成磷酸二酯鍵。3）堿變性檢測(cè)：經(jīng)高溫變性或堿變性后，重新恢復(fù)到非變性環(huán)境，不同構(gòu)型的DNA分子有不同表型。環(huán)狀DNA能保持環(huán)狀形態(tài)，但是線性（或環(huán)狀切口）DNA則會(huì)在堿變性后成為“bushes”［18］。筆者電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)堿變性后線性DNA分子還是處于變性前的條帶位置，可能分子量相同而構(gòu)型不同。4）DNA環(huán)化后轉(zhuǎn)化率檢測(cè)：完整質(zhì)粒經(jīng)化學(xué)方法轉(zhuǎn)化可產(chǎn)生104個(gè)轉(zhuǎn)化子/ng，檢測(cè)DNA環(huán)化后能否達(dá)到此種轉(zhuǎn)化率，從而證明DNA連接后是否形成完整質(zhì)粒。電泳能夠檢測(cè)DNA連接產(chǎn)物是否產(chǎn)生超螺旋條帶，但是必須≥10ng才能檢測(cè)出來。不同限制性酶切出的平端連接效率不同，Rusche發(fā)現(xiàn)Bsu限制性酶切割SPPI/pSC101 DNA產(chǎn)生的DNA在15~25℃連接效率大約達(dá)到75%。但是連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后，只達(dá)到<4%質(zhì)粒轉(zhuǎn)化率，說明質(zhì)粒DNA經(jīng)酶切后再連接不能形成完整質(zhì)粒。筆者發(fā)現(xiàn)平端DNA連接后轉(zhuǎn)化率約為4%，表明DNA連接形成質(zhì)粒的效率不高。在超螺旋質(zhì)粒DNA中加入T4 DNA連接酶，會(huì)發(fā)生RF1和RF2構(gòu)型的轉(zhuǎn)換，4h后有5%質(zhì)粒DNA是RF1構(gòu)型，由T4 DNA連接酶拓?fù)洚悩?gòu)活性產(chǎn)生。

連接酶平端連接的理性改造^[1]

硫化葉菌（Sulfolobus solfataricus）雙鏈DNA結(jié)合蛋白Sso7d具有底物結(jié)合活性，將其融合Pfu DNA聚合酶，保留了DNA擴(kuò)增的保真性，同時(shí)提高了聚合酶3’-5’外切活性，從而切去與模板非匹配堿基，提高了聚合酶持續(xù)合成能力。高保真的Phusion、Q5DNA聚合酶同樣融合了DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，從而提高了聚合酶持續(xù)合成能力。因?yàn)門4 DNA連接酶對(duì)平端DNA連接效率很低，其理性改造是融合DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。Wilson等為了提高T4 DNA連接酶連接酶對(duì)底物結(jié)合力，進(jìn)行了Sso7d與連接酶的融合研究。融合Sso7d后，T4 DNA連接酶對(duì)平端DNA連接活性提高了60%。融合人工合成的家鼠-人類嵌合型轉(zhuǎn)錄因子cTF后，T4 DNA連接酶對(duì)平端DNA和載體連接效率提高160%。融合人類轉(zhuǎn)錄因子NF-kBp50-后，E.coli DNA連接酶的連接效率也得到明顯提高。

主要參考資料

[1]賀添艷,劉亞娟,徐文選,劉猛,劉亮偉。T4DNA連接酶性質(zhì)及其平端連接功能[J]。河南科學(xué),2016,34(07):1058-1062。