背景^[1-3]

SEQPLEX DNA擴增試劑盒用于全基因組擴增（WGA）的SeqPlex增強型DNA擴增試劑盒,專門針對極小量或降解/高度片段化的DNA進行二代測序（NGS）。染色質免疫沉淀（ChIP）或福爾馬林固定的石蠟包埋組織樣品（FFPE）的DNA含量,通常不能滿足成功制備二代測序文庫的需求。

第二代測序（Next-generation sequencing，NGS）又稱為高通量測序（High-throughput sequencing），是基于PCR和基因芯片發(fā)展而來的DNA測序技術。我們都知道一代測序為合成終止測序，而二代測序開創(chuàng)性的引入了可逆終止末端，從而實現邊合成邊測序（Sequencing by Synthesis）。二代測序在DNA復制過程中通過捕捉新添加的堿基所攜帶的特殊標記（一般為熒光分子標記）來確定DNA的序列，現有的技術平臺主要包括Roche的454 FLX、Illumina的Miseq/Hiseq等。由于在二代測序中，單個DNA分子必須擴增成由相同DNA組成的基因簇，然后進行同步復制，來增強熒光信號強度從而讀出DNA序列；而隨著讀長增長，基因簇復制的協(xié)同性降低，導致堿基測序質量下降，這嚴格限制了二代測序的讀長（不超過500bp），因此，二代測序具有通量高、讀長短的特點。

二代測序適合擴增子測序（例如16S、18S、ITS的可變區(qū)），而基因組、宏基因組DNA則需要使用鳥槍法（Shotgun method）打斷成小片段，測序完畢后再使用生物信息學方法進行拼接。SeqPlex試劑盒可對這類DNA以及其他用于NGS的小量/高度片段化DNA樣品進行預擴增。該試劑盒是WGA產品線的延伸產品,已被整合到Illumina、SOLiD TM 454測序工作流程中。SEQPLEX DNA擴增試劑盒采用隨機引物技術擴增片段化DNA,如ChIP或FFPE有助于對低至100 pg的ChIP DNA進行測序采用增強型引物,可獲得完整的基因組覆蓋、最低的序列偏差、引物清除以及適用于二代測序的擴增子大小可兼容用于二代測序的Illumina、SOLiD TM或454文庫制備。

應用^[4][5]

用于高通量測序技術在非小細胞肺癌基因檢測中的應用研究

肺癌發(fā)病率最為常見的是非小細胞肺腺癌,部分基因的突變會導致肺癌的產生,如在部分患者中能檢測到EGFR、BRAF、KARS等等基因發(fā)生突變。在現階段臨床可通過定量即時聚合酶鏈鎖反應（Quantitative real time polymerase chain reaction,Q-PCR）、非放射性原位雜交技術（fluorescence in situ hybridization,Fish）、多重引物PCR（multiplex PCR）等方式對患者進行相關位點的基因突變檢測,這些技術存在一次只能檢測一個基因或檢測成本高等問題。二代高通量測序方法（Next Generation Sequence,NGS）,可有效的實現不同基因和不同藥物作用位點的一次性檢出。設計了一個含284個肺癌相關基因的探針,用于臨床肺癌樣本基因組DNA經過酶切打斷后獲得DNA文庫的雜交捕獲測序,進行非小細胞肺癌基因突變的臨床檢測。

在本研究存在4個優(yōu)點:1)建庫起始量降低至100ng;2)使用酶切建庫發(fā)替代物理超聲波打斷法;3)能同時對單核苷酸位點變異（single nucleotide variants,SNV）、插入缺失標記（insertion-deletion,Indel）、融合基因（Fusion Gene）等不同突變類型進行檢測;4)建庫時間由3天縮短至1.5天;5)同時對比了BGISEQ-500測序儀與HISEQ-4000的數據,結果顯示兩者間的一致性極高,基于成本的考慮,我們選擇了BGISEQ-500測序平臺。

本研究對已有的85例樣本,進行了EGFR基因L858R、T790M突變、E746-A750缺失、KRAS基因G12D突變和EML4-ALK融合基因的突變檢測,并比較在雙脫氧鏈終止法（sanger法）測序平臺、突變擴增系統(tǒng)（amplification refractory mutation system,ARMS）平臺、免疫組織化學技術（immunocytochemistry,IHC）平臺的一致性驗證,其符合度分別為94.1%、96.5%、95.3%、98.8%、100%,結果顯示NGS檢出結果與各平臺結果均有良好的一致性。使用自配標準品（EGFRL858R、EGFR19exondel、KRASG12D、ALKFusion）進行10%、5%、3%、2%、1%、0.5%等頻率的檢測,個別基因最低可檢出0.5%。

參考文獻

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[3]Translating genomic information into clinical medicine:lung cancer as a paradigm.Levy Mia A,Lovly Christine M,Pao William.Genome Research.2012

[4]Genome coverage and sequence fidelity of phi29 polymerase-based multiple strand displacement whole genome amplification.Paez J Guillermo,Lin Ming,Beroukhim Rameen,Lee Jeffrey C,Zhao Xiaojun,Richter Daniel J,Gabriel Stacey,Herman Paula,Sasaki Hidefumi,Altshuler David,Li Cheng,Meyerson Matthew,Sellers William R.Nucleic Acids Research.2004

[5]林木飛.高通量測序技術在非小細胞肺癌基因檢測中的應用研究[D].華南理工大學,2018.