背景^[1-4]

SEQPLEX RNA擴增試劑盒用于全轉錄組擴增（WTA）的SeqPlex RNA擴增試劑盒，專用于幫助對小量或降解/高度片段化的RNA（如來自福爾馬林固定的石蠟包埋組織樣品FFPE的RNA）進行二代測序（NGS）。SeqPlex試劑盒可對這類RNA以及其他用于NGS的小量/高度片段化RNA樣品進行預擴增。SEQPLEX RNA擴增試劑盒可在進入常用深度測序平臺工作流程之前為總RNA或分離后的mRNA提供一種擴增方法，在8小時或更短的時間內從低納克至皮克級總RNA生成微克級的雙鏈cDNA，適合對組織、培養(yǎng)細胞、福爾馬林固定的樣品或血清中分離的RNA（包括不含polyA尾的RNA）進行擴增，并同時保持未擴增樣品中所發(fā)現(xiàn)的差異表達模式。

測序準備包括三個步驟。首先，用具有半簡并3'末端以及指定通用5'末端的引物對樣品RNA進行逆轉錄。隨著DNA聚合進行，置換的單鏈可作為引物退火和延伸的新模板。接下來，由側翼為單個通用引物序列的隨機重疊片段組成的雙鏈cDNA文庫產物，在優(yōu)化的PCR條件下擴增生成WTA（全轉錄組擴增）產物。從納克級完整起始RNA開始，大部分的擴增產物大小范圍為200至400 bp。對于受損的RNA和皮克級高質量RNA，可得到150至250 bp大小范圍。最后，將SeqPlex擴增RNA與深度測序工作流程整合需要消除每個擴增子的引物序列。在樣品制備之前需要完成有效的引物去除步驟。除了深度測序外，SeqPlex擴增產品還可適用于芯片靶標或qPCR模板——無論是否進行引物去除

應用^[5][6]

用于深度測序鑒定玉米病毒及感病玉米組織中小RNA分析

明確玉米病毒種類及生物學特性是防治玉米病毒病發(fā)生的關鍵。深度測序技術突破了傳統(tǒng)病毒鑒定方法的局限性,能同時檢測植物樣品中已知的和未知的、含量高及含量低的所有RNA病毒、DNA病毒以及類病毒。這種新的測序技術極大地革新了植物病毒的檢測方法,已成為目前病毒鑒定最為重要的前沿技術之一。

本研究利用小RNA深度測序技術鑒定了云南省和貴州省玉米病毒病的種類。通過contigs拼接和比對共鑒定了7種玉米病毒,分別為3種未知的RNA病毒并依次暫命名為：玉米黃化花葉病毒(Maize yellow mosaic virus,MYMV),玉米相關的形影病毒(Maize-associated umbravirus,MAUV)以及玉米相關的整體病毒1(Maize-associated totivirus1,MATV1);1種國內首次報道的DNA病毒：留尼旺玉米線條病毒云南分離物(Maize streak Reunion virus-YN isolate,MSRV-YN);3種已知的RNA病毒：玉米褪綠斑駁病毒(Maize chlorotic mottle virus,MCMV),甘蔗花葉病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV),南方水稻黑條矮縮病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)。

利用病毒來源的contigs以及小RNA設計引物,對上述3種未知的RNA病毒以及MSRV-YN進行了全長基因組的克隆。MYMV基因組全長5,642nt,共編碼6個開放閱讀框(Open Reading Frame,ORF),其ORF的大小及編碼策略與黃癥病毒科馬鈴薯卷葉病毒屬(Polerovirus,Luteoviridae)成員非常相似。全基因組核苷酸進化樹分析以及6個ORFs的氨基酸序列進化樹分析均顯示MYMV與黃癥病毒科馬鈴薯卷葉病毒屬病毒成員聚為一簇,與該屬成員玉米黃矮病毒-ⅠMV(Maize yellow dwarf virus-RMV)形成一個小的分支,具有最高的序列同源性,兩者核苷酸序列相似性為73%,表明MYMV是該屬的一個新的病毒成員。同時,構建了MYMV的全長cDNA侵染性克隆,RT-PCR及Northern blot結果均顯示該侵染性克隆能成功地系統(tǒng)侵染本氏煙(Nicotiana benthamiana)。

參考文獻

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