概述^[1][2]

植物基因組DNA提取試劑盒(CTAB粗提法)可用于簡單快速提取植物基因組DNA，先將新鮮植物樣本研磨破碎細(xì)胞壁，加入CTBA抽提液使細(xì)胞膜破裂同時將核酸與植物多糖等雜質(zhì)分開。

操作方法^[1][2]

1．現(xiàn)場使用正壓過濾裝置，用0．22um(150cm)混合纖維膜的過濾2L水樣(藍(lán)藻群體顆粒用濾膜除去過多水分)，抽濾結(jié)束后，將濾膜剪碎并至于50ml離心管中，如果不能及時分析，-20°C保存。

2．在50ml離心管中加入4ml溶液A(50mM Tris-C1+50mMNa2EDTA+1M NaCl)，然后加10％(十二烷基肌氨酸鈉)溶液至終濃度為0.1％Sarkosyl，加入十六烷基三甲基溴化銨CetylTrimethylAmmoniumBromide至終濃度為2％。

3．取適量樣本加入上述離心管，振蕩混勻3min，然后在4°C下保存lh。

4．以8,000rpm離心15min，棄液體；用1.5ml溶液B(50mM Tris-C1+50mM Na2EDTA+ImMNaCl)處理樣本兩次(處理方法如下：加入1.5ml溶液B，振蕩混勻3min，轉(zhuǎn)移到2ml離心管中，8,000rpm離心15min，棄液。再加入1.5ml溶液B洗滌一次)，將細(xì)胞重新懸于250ml溶液C(50mM Tris-C1+50mMNa2EDTA+25％蔗糖)，室溫放置1h。

5．加入溶菌酶(100mg／m1)至終濃度為10—20mg／ml，并于37°C保溫15min，用750ul緩沖液D(10mMTris-C1+50mMNa2EDTA)稀釋細(xì)胞懸液，并再于37°C保溫30min；加入10％SDS至終濃度1，小心攪勻，繼續(xù)37°C保溫1h，直至懸液變粘。

6．加入蛋白酶K(10mg／m1)至終濃度100ug／ml，再于37°C保溫2h。

7．用酚／氯仿(25：24)抽提一次(分2管加入2ml離心管，因?yàn)榧尤敕樱确?min，吸上清)，用2倍體積的無水乙醇沉淀核酸，4。C放置1h或過夜；以(12，000rpm30mkn)離心沉淀核酸并晾干(15-20min)。

8．將沉淀溶于150ulTE緩沖液中，加入Rnase(10mg／ml至終濃度100ug／ml消化RNA，37°C保溫1h，然后用酚／氯仿(25：24)抽提一次(10，000g離心5min，吸上清)，再用氯仿抽提一次(10，000g離心5min，吸上清)，加入5M NaCl至終濃度為1M，并用2倍體積的冰冷乙醇沉淀DNA，4°C放1h或過夜，再次以(12，000rpm30min)離心沉淀DNA，并將其溶于100ul的TE緩沖液中。如果樣本濃度過低，可以加50ulTE溶解，定量后再決定是否要補(bǔ)加TE。使用NanoDrop進(jìn)行質(zhì)量檢測。

9．質(zhì)檢結(jié)果不理想的樣本，用PowerClean⑩DNAClean-Upkit進(jìn)行純化。

10．提取好的DNA置于-20°C保存。

主要參考文獻(xiàn)

[1] 雷婭紅 進(jìn)境多年生黑麥草和白三葉種帶真菌多樣性研究 蘭州大學(xué) 碩士生學(xué)位論文。

[2]  張軍毅  太湖藍(lán)藻水華的宏基因組學(xué)研究 東南大學(xué) 博士學(xué)位論文。