背景^[1-6]

普通質(zhì)粒小提試劑盒采用經(jīng)典的堿裂解法裂解細(xì)菌，再通過離心吸附柱在高鹽狀態(tài)下特異性地結(jié)合DNA的特性，可以從1–5ml大腸桿菌LB培養(yǎng)液中快速提取3–20μg純凈的高拷貝質(zhì)粒DNA。提取的質(zhì)?？蛇m用于各種常規(guī)操作，包括酶切、PCR、測序、連接和轉(zhuǎn)化等實(shí)驗(yàn)。然而，對質(zhì)粒純度要求更高的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)（要求無內(nèi)毒素），此試劑盒不能達(dá)到要求。另外，盡管該試劑盒可以抽提較大的質(zhì)粒（>10kb），但不推薦使用。

如果一定要使用，請參考以下方法：加大菌體使用量（使用5–10 ml過夜培養(yǎng)物），同時(shí)按照比例增加P1、P2、P3的用量；洗脫緩沖液應(yīng)在70℃預(yù)熱，在吸附和洗脫時(shí)可以適當(dāng)?shù)难娱L時(shí)間，以增加提取效率，其它步驟相同。

產(chǎn)品特點(diǎn)

使用了Lysis Dye，菌體裂解是否完全一目了然。由于判斷菌體裂解和中和是否徹底更主要取決于操作者的經(jīng)驗(yàn)，所以我們增加了Lysis Dye（一種能使裂解/中和體系變換顏色的試劑）來幫助觀察裂解/中和的程度。加入P1后，Lysis Dye使菌液變?yōu)闇啙岬募t色；加入P2后，Lysis Dye立即使溶液變?yōu)槌吻宓募t色，裂解是否完全只要觀察紅色溶液是否澄清，如果紅色非常均一，表明裂解充分；在完全裂解的體系中加入P3混勻后，體系立即變?yōu)辄S色，任何紅色的殘留表明沒有完全混勻或者中和不徹底。

注意：1.為了增加質(zhì)粒的回收效率，可將得到的洗脫液重新加入離心吸附柱中，再次離心收集。

2.洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于50μl，體積過小影響回收效率。

3.洗脫液的pH值對于洗脫效率有很大影響。若用水做洗脫液應(yīng)保證其pH值在7.0-8.5范圍內(nèi)，pH值低于7.0會(huì)降低洗脫效率。

應(yīng)用^[7][8]

普通質(zhì)粒小提試劑盒可用于大腸桿菌利用木聚糖合成木糖醇的研究

木糖醇是一種重要的工業(yè)用精細(xì)化學(xué)品、糖基化學(xué)品，具備許多優(yōu)異特性，廣泛用于化工、醫(yī)藥、食品及飼料等行業(yè)。傳統(tǒng)的木糖醇生產(chǎn)，一般采用酸解法將半纖維素降解為木糖，而后以純化的木糖為底物，采用化學(xué)或生物全細(xì)胞催化法將木糖轉(zhuǎn)化為木糖醇，整個(gè)制備工藝復(fù)雜、安全性差、成本高、環(huán)境污染嚴(yán)重，與我國經(jīng)濟(jì)發(fā)展可持續(xù)、可循環(huán)、節(jié)能減排的工業(yè)目標(biāo)不相符。

針對上述問題以大腸桿菌為宿主，通過對其相關(guān)啟動(dòng)子特性的研究，利用合成生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建新的大腸桿菌，可直接利用木聚糖合成木糖醇，從而為實(shí)現(xiàn)清潔生產(chǎn)木糖醇開辟一條新型工藝。研究結(jié)果如下：（1）以加強(qiáng)型綠色熒光蛋白（eGFP）為報(bào)告基因，對克隆的組成型啟動(dòng)子Ppgi、PgapA、PpykA、PpykF和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子PT7進(jìn)行表征，測得熒光強(qiáng)度依次為102.18、784.12、94.04、163.20和8785.87，組成型啟動(dòng)子中PgapA熒光強(qiáng)度，PT7的熒光強(qiáng)度是PgapA的11.2倍。（2）利用DNA assembler方法，運(yùn)用PgapA構(gòu)建木聚糖水解為木糖的途徑，得到表達(dá)載體pRS42K-xyn-xyl，將其導(dǎo)入原始菌株BL21(DE3)中，獲得工程菌株BL21-xyn-xyl，此菌株可成功將木聚糖水解為木糖。（3）采用PT7和PgapA分別構(gòu)建了轉(zhuǎn)化木糖為木糖醇的表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-T7-xr和pET-28a(+)-gapA-xr，導(dǎo)入原始菌株BL21(DE3)后獲得工程菌BL21-T7-xr和BL21-gapA-xr。確定了工程菌BL21-T7-xr的IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度以及初始木糖濃度分別為0.2mM、25℃、10g/L，此時(shí)木糖醇的產(chǎn)量為2.92g/L；工程菌BL21-gapA-xr的初始木糖濃度15g/L，此時(shí)木糖醇的產(chǎn)量為8.48g/L。比較條件下兩株工程菌的木糖醇生產(chǎn)情況，發(fā)現(xiàn)菌株BL21-gapA-xr的木糖醇產(chǎn)量更高，說明組成型啟動(dòng)子PgapA更加有利于木糖醇的生產(chǎn)。進(jìn)一步確定了工程菌BL21-gapA-xr的木糖補(bǔ)料濃度為8g/L，此時(shí)木糖醇產(chǎn)量達(dá)到最高為40.6g/L。（4）將表達(dá)質(zhì)粒pRS42K-xyn-xyl和pET-28a(+)-gapA-xr同時(shí)導(dǎo)入敲除木糖異構(gòu)酶基因的工程菌株BL21-T中，得到集成菌株BL21-xyn-xyl-xr-T。

參考文獻(xiàn)

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