80619-01-8
中文名稱
膽紅素氧化酶
英文名稱
BILIRUBIN OXIDASE
CAS
80619-01-8
分子式
N/A
更新日期
2025/01/07 16:12:34
基本信息
中文別名
膽紅素氧化酶膽紅素氧化酶/BOD
膽紅素氧化酶, 10 單位/每毫克蛋白
膽紅素氧化酶, ≥ 50U/MG PROTEIN
BILIRUBIN OXIDASE 膽紅素氧化酶
英文別名
C:C&B9EC 1.3.3.5
Biliruin Oxidase
BILIRUBIN OXIDASE
Oxidase, bilirubin
Bilirubin oxidase M-1
Bilirubin oxidase Amano 3
Bilirubin Oxidase [≥50 units/mg]
BILIRUBIN: OXYGEN OXIDOREDUCTASE
Bilirubin Oxidase [>=10 units/mg]
常見問題列表
背景介紹
膽紅素是動物體內(nèi)含鐵卟啉化合物進行正常分解代謝的產(chǎn)物，是鐵葉琳化合物在人體內(nèi)代謝產(chǎn)物之一。膽紅素在體內(nèi)起著重要的作用，它是一種抗氧化劑，有助于肝細胞的再生。但是，一旦出現(xiàn)代謝異常，膽紅素就會在體內(nèi)積累，形成高膽紅素血癥，甚至黃疸。凡能引起膽紅素生成過多或使肝細胞對膽紅素的攝取、結(jié)合和排泄過程發(fā)生障礙，都會使血中的膽紅素濃度升高，出現(xiàn)高膽紅素血癥。因此，膽紅素的測定對臨床檢測肝膽疾病、溶血等具有重要的意義。膽紅素氧化酶（bilirubin：oxygen oxidoreductase，EC1.3.3.5，BOD/Br/BOX）是一種多酚氧化酶，最開始對膽紅素氧化酶進行研究的是國外的兩名學者Murao和Tanaka，他們從漆斑菌屬真菌中純化出膽紅素氧化酶，為后來膽紅素氧化酶的各項研究及應(yīng)用奠定了重要理論基礎(chǔ)。膽紅素氧化酶的來源特別廣泛，漆斑菌屬是其主要來源和高產(chǎn)菌，產(chǎn)生膽紅素氧化酶的微生物有鏈霉菌屬、弗蘭克氏菌、粗皮靈芝、微紫青霉菌等；Maitins在研究中發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌、芽孢外衣蛋白也有膽紅素氧化酶活性；此外，國外科研人員在馬鈴薯洋蔥苜蓿和番茄等植物中也都陸續(xù)分離出膽紅素氧化酶。膽紅素氧化酶能催化膽紅素反應(yīng)生成無毒害作用的膽綠素，主要被用于測定血清中膽紅素的含量，而血清中膽紅素含量的多少可以作為肝膽病情診斷的重要依據(jù)，也能為病理分析提供信息。
結(jié)構(gòu)特點
膽紅素氧化酶全酶是由蛋白質(zhì)、二價銅離子和部分碳水化合物組成。蛋白質(zhì) 由17種氨基酸組成，不含半胱氨酸、賴氨酸和蛋氨酸含量較低，每個分子中不到10個殘基；天冬氨酸、谷氨酸和丙氨酸含量較高，每個分子中的殘基數(shù)超過 40個。膽紅素氧化酶的前體是由572個氨基酸殘基組成，包括534個氨基酸和38個氨基酸的前導區(qū)。前導區(qū)中碳末端的個疏水氨基酸與已知信號肽特征相似，可能也起著信號肽的作用。膽紅素氧化酶（BOD）的光譜學特性與多銅氧化酶基本相似，純化后的BOD常呈深藍色，BOD中含有的銅離子依光譜學和磁學特性被分為3種類型，T1銅中心接受來自于酶的有機底物電子供體如膽紅素并將所得電子傳遞到O2還原位點，目前被廣泛接受的觀點是該蛋白的紫外-可見光譜在約600nm處有一強吸收T1銅特征吸收峰，這主要源于酶底物中的電荷從Cys-S到T1CuII的傳遞繼而電子再被傳遞至O2還原位點，這一位點由1個三核中心組成，包含1個具有電子 順磁共振活性的T2Cu2+中心和一對逆磁性與羥基耦合的T3銅離子該三核銅中心，，在UV-Vis區(qū)約330nm處有一明顯的寬肩作為其特征，2010年億報道從M．verrucarria分離純化并獲得首個BOD晶體結(jié)構(gòu)，此后有關(guān)此酶晶體結(jié)構(gòu)的進一步研究也陸續(xù)被報道。
催化機制
膽紅素氧化酶是一種含銅的多酚氧化酶，它包含三種類型的銅離子。一個I型銅離子介導電子從底物傳到其他銅位點，氧分子束縛在一個II型銅離子和兩個III型銅離子形成三核中心上，被還原為兩個水分子。所以其催化過程是利用分子氧作為電子受體，有水生成的氧化反應(yīng)。經(jīng)電子吸收光譜及薄層色譜技術(shù)測定，具體反應(yīng)為 ，過程為膽紅素氧化酶催化膽紅素生成膽綠素，后者進一步氧化生成部分性質(zhì)還不明確的無色物質(zhì)。研究表明膽紅素氧化酶的催化機制是對于被束縛在蛋白質(zhì)上銅離子的二級反應(yīng)，供體結(jié)構(gòu)為CuSS*N2(S=Cys，S*=Met，N=His)類型，和銅藍蛋白家族相同（如下圖）。在對黃疽血液進行膽紅素氧化酶反應(yīng)中，用HPLC法測定血液中膽紅素濃度在用膽紅素氧化酶催化后的變化，發(fā)現(xiàn)膽紅素氧化酶可以氧化結(jié)合型膽紅素，也可以氧化非結(jié)合型膽紅素。在ph=5.5和氟化鈉等試劑存在時，膽紅素氧化酶能選擇性地氧化結(jié)合型膽紅素。這種方法能被用于檢測病人血清中結(jié)合膽紅素濃度的變化。
最適溫度及穩(wěn)定性
膽紅素氧化酶（BOD）酶活與溫度沒有明顯的相關(guān)關(guān)系。M.oryzae BOD酶活最高溫度為60℃，CotABOD酶活最高溫度達80 ℃，而來自M．verrucarria的BOD酶活最高溫度只有40 ℃。在多銅氧化酶家簇中CotA蛋白具有最高的熱穩(wěn)定性，在80℃下半衰期100min，而表現(xiàn)出細菌蛋白酶的顯著特性。目前對此現(xiàn)象的解釋有2種，1種使這種蛋白分子的結(jié)構(gòu)較其他蛋白更加緊密，另一種是通過蛋白晶體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)這種蛋白中的銅被埋在蛋白質(zhì)更深的結(jié)構(gòu)里所致。在真菌BOD中來源于M.oryzae的BOD是目前發(fā)現(xiàn)最穩(wěn)定的一個，其半衰期在37℃下300min，在60℃下70min，相比之下自然分泌的M．verrucarriaBOD在60 ℃下的半衰期只有15min，而其在Pachiapastoris中表達的重組蛋白半衰期在相同溫度下可達90min。來自T．tsunodae的BOD14在37℃下90min后酶活喪失50％，與漆酶不同BODs在中性條件下穩(wěn)定如來自于M.oryzae的BOD在生理條件下孵育8d只喪失15％的酶活性。應(yīng)用
- 用于臨床檢測和治療
- 用于環(huán)境污水的處理
- 用于生物電池的制造
分離純化
露濕漆斑菌產(chǎn)生的膽紅素氧化酶粗酶液通過硫酸銨沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow 和Sephadex G-100 純化，得到純化152.54倍膽紅素氧化酶，得率19.14 %。酶的分離與純化過程為：
1）硫酸銨鹽析、透析：菌種在 28℃下、P DB培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)5d后，經(jīng)8 層紗布過濾，6000r/min 離心20 min ，所得上清液冷凍過夜，解凍除去沉淀， 上清液即為粗酶液。80 %飽和度硫酸銨沉淀，4℃ 靜置過夜。10000r/min離心20 min，棄去上清液，沉淀溶解于蒸餾水中，對其透析過夜。
2）DEAE-Sepharose Fast Flow 柱層析：將上述所得酶液加到已用0.01mol/ L 磷酸鈉緩沖液（PBS7.0）平衡過的DEAE-Sepharose Fast Flow柱（1.8 cm×20 cm）， 先用PBS 洗柱，后改用含0～0.5 mol/LNaCl的PBS梯度洗脫，合并有酶活組分， 將所得溶液冷凍干燥成粉。
3）Sephadex G-100 柱層析：將上述所得活力組分的凍干粉溶解于3mL蒸餾水中，所得酶液加到平衡好的層析柱（2.0 cm×80 cm）上，用上述緩沖液洗脫，收集活力較高的組分，并將其凍干，溶解在 2mL的蒸餾水中，-20 ℃下保存。
主要參考資料
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