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細(xì)胞培養(yǎng)操作規(guī)程：
一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：
1）準(zhǔn)備RPMI-1640培養(yǎng)基(RPMI-1640：GIBCO，貨號(hào)21875-091)，90%；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%。
2）培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配，液氮儲(chǔ)存。
二．細(xì)胞處理：
1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
對(duì)于懸浮細(xì)胞，傳代可參考以下方法：
方法一：收集細(xì)胞，1000RPM，常溫條件下離心5分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻，將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
以下是大鼠胎兒真皮成纖維細(xì)胞圖片的訂購信息：

       產(chǎn)品描述：公司提供的原代細(xì)胞均來自新鮮組織，公司提供的人源原代細(xì)胞均來自新鮮組織，用于培養(yǎng)該細(xì)胞的組織采集是根據(jù)國際標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行。細(xì)胞的培養(yǎng)采用公司PrimaCellTM原代細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒來優(yōu)化目的細(xì)胞生長條件，以降低雜細(xì)胞的污染，同時(shí)保證質(zhì)量的穩(wěn)定。在公司技術(shù)部標(biāo)準(zhǔn)的操作流程下，原代細(xì)胞可以保持分化狀態(tài)，進(jìn)而可以用于評(píng)估體外藥物模型系統(tǒng)和調(diào)節(jié)特定基因的遺傳功能。

      發(fā)貨：客戶可根據(jù)自身科研項(xiàng)目的需要選擇不同類型的細(xì)胞培養(yǎng)瓶和相應(yīng)的細(xì)胞密度。公司提供的細(xì)胞有標(biāo)準(zhǔn)的鑒定流程，保證細(xì)胞的純度在90%以上，且不含有 HIV-1、 HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌等。發(fā)貨的新鮮細(xì)胞還包含:1、發(fā)貨的T25方瓶中裝滿50ml左右完全培養(yǎng)基；2、說明書及注意事項(xiàng)；3、公司售后服務(wù)標(biāo)準(zhǔn)。

      保存和應(yīng)用：客戶可以根據(jù)自己的需求選擇新鮮或者凍存的原代細(xì)胞，如是新鮮原代細(xì)胞，客戶收到細(xì)胞后應(yīng)立即將其放入CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)靜置后2-3h，再進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)操作。如是凍存細(xì)胞，客戶收到細(xì)胞后應(yīng)立即將其放入液氮、-80℃冰箱或立即進(jìn)行復(fù)蘇。該細(xì)胞只可用于科研，不得用于臨床應(yīng)用。
實(shí)驗(yàn)報(bào)告：
一分離與培養(yǎng)：
    1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大小；
    2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 胰酶和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；
    3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織完全被消化；
    4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
    5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；
二、免疫熒光鑒定：
    1、待心房肌細(xì)胞生長至80%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；
    2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；
    3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；
    4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過夜；
    5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；
    6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。
2,4-二羥基-3-硝基吡啶Human CK-MB(Creatine Kinase MB Isoenzyme) ELISA Kit

4,6-二甲氧基-2-甲磺?；奏uman GHRL(Ghrelin) ELISA Kit

4,6-二甲氧基-2-甲磺?；奏uman EPO(Erythropoietin) ELISA Kit

[(4-(N,N-二甲氨基)苯基]二叔丁基膦Human AFP(alpha Fetoprotein) ELISA Kit

[(4-(N,N-二甲氨基)苯基]二叔丁基膦Human CA-125(CarbohydRate Antigen 125) ELISA Kit

二乙氧基甲烷Human CA19-9(CarbohydRate antigen19-9) ELISA Kit

二乙氧基甲烷Human CYFRA21-1(CytokeRatin Fragment Antigen 21-1) ELISA Kit

N-(3-二甲氨基丙基)甲基丙烯酰胺Human HE4(Epididymal Protein 4) ELISA Kit

N-(3-二甲氨基丙基)甲基丙烯酰胺Human MMP14(Matrix metalloproteinase-14) ELISA Kit

癸二酸二丁酯Human NSE(Neuron-specific Enolase) ELISA Kit

二乙酸二丁基錫Human NNE(Non-Neuronal Enolase) ELISA Kit

二乙酸二丁基錫Human INS(Insulin) ELISA Kit

二甲基三硫Human CT(Calcitonin) ELISA Kit

二甲基三硫Human D2D(D-Dimer) ELISA Kit

1-溴-3-甲基-2-丁烯Human S100A1/S100(Protein S100-A1) ELISA Kit
大鼠胎兒真皮成纖維細(xì)胞圖片BetaGAL(Mouse Beta-galactosidase) ELISA Kit  小鼠β半乳糖苷酶新補(bǔ)骨脂異黃酮 分析標(biāo)準(zhǔn)品，≥98%carnitine-acylcarnitine translocase,CACT ELISA Kit

BetaGAL(Human Alpha-galactosidase) ELISA Kit  人β半乳糖苷酶葒草苷 分析標(biāo)準(zhǔn)品，≥99%Carnitine O-acetyltransferase/Carnitine acetylase,CRAT/CAT1 ELISA kit

Beta-EPR(Mouse Beta-Endorphin receptor) ELISA Kit  小鼠β內(nèi)啡肽受體千層紙素A  分析標(biāo)準(zhǔn)品，≥98%lyso-platelet activating factor,lyso-PAF ELISA Kit

Beta-EPR ELISA Kit  大鼠β內(nèi)啡肽受體紫草素  分析標(biāo)準(zhǔn)品，≥97%HLAMP-2 ELISA Kit

Beta-EP(mouse Beta-Endorphin) ELISA Kit  小鼠β內(nèi)啡肽毛蕊花糖苷 分析標(biāo)準(zhǔn)品Lysozyme,LZM ELISA Kit

Beta-EP(human Beta-Endorphin) ELISA Kit  人β內(nèi)啡肽漢黃芩甙 分析標(biāo)準(zhǔn)品，≥98%Chorionic Gonadotrophin,HCG ELISA Kit

Beta-EP ELISA Kit  大鼠β內(nèi)啡肽花椒毒酚 分析標(biāo)準(zhǔn)品，≥98%PAPP-A ELISA Kit

Beta-EP (Rabbit Beta-Endorphin) ELISA Kit  兔子β內(nèi)啡肽9-蒽醛 99%Pregnancy Specific Protein B,PSPB ELISA Kit

Beta-DF ELISA Kit  大鼠β-防御素9-蒽甲酸 98%Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 4,PSG4 ELISA kit

Beta-CG(Mouse Chorionic Gonadotrophin Beta) ELISA Kit  小鼠絨毛膜促性腺激素β9-蒽醇 98%SP1/PSβ1-G ELISA Kit

Beta-CG(Human Chorionic Gonadotrophin Beta) ELISA Kit  人絨毛膜促性腺激素β二氯乙酸 AR，98%Herpes Gestation,HG ELISA Kit

Beta-CG ELISA Kit  大鼠絨毛膜促性腺激素β二氯乙酸 GR,99%Heat Shock Protein glycoprotein 96,HSP gp96 ELISA Kit

Beta2-MG  β2-微球蛋白9-芴甲醇 99% heat shock protein 90kDa beta你
培養(yǎng)操作：
1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有 1mL 細(xì)胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，加 入 4mL 培養(yǎng)基混合均 勻。在 1000RPM 條件下離心 4 分鐘，棄去上清液，補(bǔ) 加 1-2mL 培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培 養(yǎng)過夜（或?qū)?細(xì)胞懸液加入 10cm 皿中，加入約 8ml 培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并 檢查細(xì)胞密度。
2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá) 80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。      
1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的 PBS 潤洗細(xì)胞 1-2 次。
2. 加 1ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于 37℃培 養(yǎng)箱中消化 1-2 分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分 變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng) 瓶后加少量培養(yǎng)基終止消 化。  
3. 按 6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在 1000RPM 條件下離心 4 分 鐘，棄去上清液，補(bǔ)加 1-2mL 培養(yǎng)液后吹勻。
4. 將細(xì)胞懸液按 1：2 比例分到新的含 8ml 培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3）細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面 T25 瓶為類；
1. 細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后，PBS 清洗一遍后加入 1ml 胰酶，細(xì)胞變圓 脫 落后，加入 1ml 含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。
2. 4 min 1000rpm 離心去掉上清。加 1ml 血清重懸細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加 入血 清和 DMSO，輕輕混勻，DMSO 終濃度為 10%，細(xì)胞密度不低于1x106/ml，每支凍存管凍存 1ml 細(xì)胞懸液，注意凍 存管做好標(biāo)識(shí)。
3. 將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80 度冰箱，2 個(gè)小時(shí)以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取.