細胞凋亡檢測試劑盒(Annexin V-FITC/PI)

中文名稱：細胞凋亡檢測試劑盒(Annexin V-FITC/PI)

英文名稱：Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit

產(chǎn)品規(guī)格：20T|50T|100T

本試劑盒是用FITC標記的Annexin V作為探針，來檢測細胞早期凋亡的發(fā)生?？捎糜诹魇郊毎麅x、熒光顯微鏡進行檢測。

其檢測原理為：在正常的活細胞中，磷脂酰絲氨酸（phosphotidylserine，PS）位于細胞膜的內側，但在早期凋亡的細胞中，PS從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面，暴露在細胞外環(huán)境中。Annexin-Ⅴ（膜聯(lián)蛋白-V）是一種分子量為35-36kDa的Ca²⁺依賴性磷脂結合蛋白，能與PS高親和力結合，可通過細胞外側暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結合。

另外，本試劑盒中還提供了碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）用來區(qū)分存活的早期細胞和壞死或晚期凋亡細胞。PI是一種核酸染料，它不能透過正常細胞或早期凋亡細胞的完整的細胞膜，但可以透過凋亡晚期和壞死細胞的細胞膜而使細胞核染紅。因此，將Annexin V與PI聯(lián)合使用時，PI則被排除在活細胞（Annexin V-/PI-）和早期凋亡細胞（Annexin V+/PI-）之外，而晚期凋亡細胞和壞死細胞同時被FITC和PI結合染色呈現(xiàn)雙陽性（Annexin V+/PI+）。

試劑盒組成：
 

保存條件：-20℃避光長期保存，避免反復凍融，一年有效。

注意事項：
1．由于細胞凋亡是一個快速的過程，建議樣品在染色后1小時之內進行分析。
2．對于貼壁細胞，消化是一個關鍵步驟。貼壁細胞誘導細胞凋亡時如有漂浮細胞，需收集漂浮細胞和貼壁細胞后合并染色。處理貼壁細胞時要小心操作，盡量避免人為的損傷。胰酶消化時間過短，細胞需要用力吹打才能脫落，容易造成細胞膜的損傷；PI攝入過多，消化時間過長，細胞膜同樣易造成損傷，甚至會影響細胞膜上磷脂酰絲氨酸與Annexin V-FITC的結合。消化時將胰酶鋪滿孔板底后，輕搖使胰酶與細胞充分接觸，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余少量胰酶再消化一段時間，待細胞間空隙增大，瓶底呈花斑狀即可終止。在消化液中盡量不用EDTA，EDTA會影響Annexin V與PS的結合。
3．實驗中如需要固定細胞，比如在檢測凋亡的同時檢測細胞周期，只能選用Annexin V-FITC，而不能選用Annexin V-EGFP，因為在固定過程中EGFP會變性導致喪失激發(fā)熒光的能力。固定前需要先將細胞與Annexin V-FITC進行孵育，并用Binding buffer洗掉未結合的Annexin V-FITC。因為固定過程中細胞通透性增加會產(chǎn)生細胞碎片，可以和Annexin V結合，對結果產(chǎn)生干擾。
4．如果樣品來源于血液，請務必除去血液中的血小板。因為血小板含有PS，能與Annexin V結合，從而干擾實驗結果?？梢允褂煤蠩DTA的緩沖劑并在200g離心洗去血小板。
5．試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內壁上的液體甩至管底，避免開蓋時液體灑落。
6．Annexin V-FITC和PI是光敏物質，在操作時請注意避光。

操作方法：

一、樣品染色

1．收集細胞
  懸浮細胞：300g，4℃離心5min收集細胞。
  貼壁細胞：用不含EDTA的胰酶消化后，300g，4℃離心5min收集細胞。胰酶消化時間不宜過長，以防引起假陽性。
2．用預冷的PBS洗滌細胞2次，每次均需300g，4℃離心5min。收集1～5×10⁵細胞。
3．吸棄PBS，加入100μL 1×Binding Buffer重懸細胞。
4．加入5μL Annexin V-FITC和10μL PI Staining Solution，輕輕混勻。
5．避光、室溫反應10-15min。
6．加入400μL 1×Binding Buffer，混勻后放置于冰上，樣品在1小時內用流式細胞儀或熒光顯微鏡檢測。
  注意：為了避免洗滌細胞時損失細胞，在吸液時可以用大的Tip頭套上小的Tip頭吸液。

二、樣品分析

A．流式細胞儀分析：
  FITC激發(fā)波長為488nm，發(fā)射波長525nm，F(xiàn)ITC的綠色熒光在FL1通道檢測；PI-DNA復合物的激發(fā)波長為535nm，發(fā)射波長為615nm，PI的紅色熒光在FL2或FL3通道檢測。用CellQuest等軟件進行分析，繪制雙色散點圖（two-color dot plot），F(xiàn)ITC為橫坐標，PI為縱坐標。典型的實驗中，細胞可以分成三個亞群，活細胞僅有很低強度的背景熒光，早期凋亡細胞僅有較強的綠色熒光，晚期凋亡細胞有綠色和紅色熒光雙重染色。

B．熒光顯微鏡分析：
1．滴一滴用Annexin V-FITC/PI雙染的細胞懸液于載玻片上，并用蓋玻片蓋上細胞。
  注意：對于貼壁細胞，可直接用蓋玻片培養(yǎng)細胞并誘導細胞凋亡。
2．在熒光顯微鏡下用雙色濾光片觀察。Annexin V-FITC熒光信號呈綠色，PI熒光信號呈紅色。

特別提示：本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！