Annexin V-PE/7-AAD雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒

中文名稱：Annexin V-PE/7-AAD雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒

英文名稱：Annexin V-PE/7-AAD Apoptosis Detection Kit

產(chǎn)品規(guī)格：10T|20T|50T|100T

本試劑盒可應(yīng)用于培養(yǎng)細(xì)胞凋亡檢測(cè)（不推薦用于檢測(cè)組織樣本）。

在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜中的磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。Annexin V是一種分子量為35～36kD的Ca²⁺依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過(guò)細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。因此Annexin V被作為檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。將Annexin V進(jìn)行熒光素PE標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin V作為熒光探針，利用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

7-AAD（7-amino-actinomycin D）是一種核酸染料，它不能通過(guò)正常質(zhì)膜，隨著細(xì)胞凋亡、細(xì)胞死亡過(guò)程，質(zhì)膜對(duì)7-AAD的通透性逐漸增加，結(jié)合細(xì)胞凋亡中DNA的有控降解，在合適波長(zhǎng)激發(fā)光的激發(fā)下可發(fā)出明亮的紅色熒光，通過(guò)7-AAD標(biāo)記DNA的強(qiáng)弱，將細(xì)胞分為三群：7-AAD強(qiáng)為死亡細(xì)胞，7-AAD弱是凋亡細(xì)胞，7-AAD-為正?；盍?xì)胞。7-AAD同PI有著相似的熒光特性，但其發(fā)射波譜較PI窄，對(duì)其他檢測(cè)通道的干擾更小，在多色熒光分析中是PI的替代品，可與Annexin V-PE聯(lián)合使用。

試劑盒組成：
 

保存條件：2～8℃避光，有效期1年。

試劑盒以外自備儀器和試劑
流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡、低速離心機(jī)、微量移液器、1.5mL Microtube、載玻片、蓋玻片（熒光顯微鏡觀察需用）、PBS、不含EDTA的胰酶消化液

使用注意事項(xiàng)：
1．微量試劑取用前請(qǐng)離心集液。
2．Annexin V-PE/7-AAD避光保存及使用。
3．7-AAD為潛在致癌物，操作時(shí)請(qǐng)采取防護(hù)措施，穿防護(hù)服、戴手套等。
4．本試劑盒適用于檢測(cè)活細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)時(shí)，細(xì)胞數(shù)量不以應(yīng)低于1×10⁵，不推薦用于檢測(cè)組織樣本。
5．推薦使用懸浮培養(yǎng)細(xì)胞。如果是貼壁細(xì)胞，建議適用不含EDTA的胰酶消化，如消化不當(dāng)，可能引起假陽(yáng)性，而用細(xì)胞刮子會(huì)造成細(xì)胞粘連成團(tuán)，而影響檢測(cè)?？蓪⒁让赶蠹?xì)胞的保存在含2%BSA的PBS中，防止進(jìn)一步的損傷。
6．細(xì)胞固定后可能導(dǎo)致熒光的淬滅，請(qǐng)不要固定樣品。
7．因檢測(cè)細(xì)胞的類型、凋亡誘導(dǎo)劑種類、使用的檢測(cè)儀器不同，因而流式檢測(cè)的熒光補(bǔ)償也不同，因此建議每次檢測(cè)均需使用未經(jīng)凋亡誘導(dǎo)處理的細(xì)胞作為對(duì)照，進(jìn)行熒光補(bǔ)償?shù)恼{(diào)節(jié)。

操作方法：

1．懸浮細(xì)胞離心（2000rpm離心5min）收集；貼壁細(xì)胞用不含EDTA的胰酶消化收集；
  注：胰酶消化時(shí)間不易過(guò)長(zhǎng)，否則容易引起假陽(yáng)性。
2．用PBS洗滌細(xì)胞二次（2000rpm離心5min）收集1~5×10⁵細(xì)胞；
3．在50μL的Binding Buffer中加入5μL 7-AAD染液，混勻；
4．收集細(xì)胞中加入上述7-AAD染液，混勻；室溫、避光、反應(yīng)5～15min；
5．反應(yīng)后再加入450μL的Binding Buffer混勻；
6．加入1μL Annexin V-PE混勻；室溫、避光、反應(yīng)5～15min；
7．請(qǐng)?jiān)?小時(shí)內(nèi)，進(jìn)行下述熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀的觀察和檢測(cè)。

A．熒光顯微鏡觀察
1．滴一滴上述染色后的細(xì)胞懸液于載玻片上，并用蓋玻片蓋上細(xì)胞；
2．對(duì)于貼壁細(xì)胞來(lái)說(shuō)，也可直接用蓋玻片來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；
① 將細(xì)胞于蓋玻片上生長(zhǎng)，用適當(dāng)?shù)牡蛲稣T導(dǎo)劑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并設(shè)立陰性對(duì)照組；
② 用PBS洗滌細(xì)胞兩次；
③ 在500μL的Binding Buffer中加入1μL Annexin V-PE，5μL 7-AAD染液混勻；
④ 將上述溶液滴加于蓋玻片表面，使長(zhǎng)有細(xì)胞的蓋玻片表面均勻覆蓋；
⑤ 避光、室溫反應(yīng)5min。
3．將蓋玻片倒置于載玻片上，于熒光顯微鏡下濾光片（羅丹明）觀察Annexin V-PE熒光信號(hào)呈橙紅色；激發(fā)波長(zhǎng)546nm，發(fā)射波長(zhǎng)647nm，觀察7-AAD熒光信號(hào)呈紅色。

B．流式細(xì)胞儀分析
1．用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)Ex=488nm;發(fā)射波長(zhǎng)Em=578nm，Annexin V-PE的橙紅色熒光建議使用FL2通道檢測(cè)；激發(fā)波長(zhǎng)Ex=546nm;發(fā)射波長(zhǎng)Em=647nm，7-AAD紅色熒光建議使用FL3通道檢測(cè)。
2．熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)：使用經(jīng)凋亡誘導(dǎo)處理的正常細(xì)胞，作為對(duì)照進(jìn)行熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)去除光譜重疊和設(shè)定十字門(mén)的位置。

特別提示：本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！