細胞毒性檢測試劑盒(乳酸脫氫酶法)

中文名稱：細胞毒性檢測試劑盒(乳酸脫氫酶法)

英文名稱：LDH Cytotoxicity Assay Kit

產(chǎn)品規(guī)格：100次|500次

本試劑盒也稱乳酸脫氫酶檢測試劑盒(LDH Assay Kit)或乳酸脫氫酶釋放檢測試劑盒(LDH Release Assay Kit)，是一種基于diaphorase催化的INT顯色反應，通過比色法檢測細胞毒性時釋放的乳酸脫氫酶活性或檢測其它樣品中的乳酸脫氫酶活性的試劑盒。

本試劑盒可以用于常規(guī)的乳酸脫氫酶活性的檢測，更常用于以LDH釋放為指標的細胞毒性檢測。同時，基于細胞總乳酸脫氫酶活性的檢測，本試劑盒也可以用于檢測細胞增殖和細胞毒性檢測。

細胞凋亡或壞死而造成的細胞膜結構的破壞會導致細胞漿內(nèi)的酶釋放到培養(yǎng)液里，其中包括酶活性較為穩(wěn)定的乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)。通過檢測從質(zhì)膜破裂的細胞中釋放到培養(yǎng)液中的LDH的活性，就可以實現(xiàn)對細胞毒性的定量分析。LDH釋放被看做細胞膜完整性的重要指標，并被廣泛用于細胞毒性檢測。LDH釋放被認為是以前使用放射性的51Cr標記細胞，隨后通過51Cr釋放進行細胞膜完整性檢測的安全有效的替代方法。

本試劑盒的基本原理是，在乳酸脫氫酶的作用下，NAD+被還原生成NADH，NADH和INT(2-p-iodophenyl-3-nitrophenyl tetrazolium chloride)被硫辛酰胺脫氫酶(diaphorase)催化反應生成NAD+和強生色物甲臜(formazan)，在490nm波長下產(chǎn)生吸收峰，從而可以通過比色來定量乳酸脫氫酶的活性。吸光度與乳酸脫氫酶活性成線性正相關。該酶聯(lián)反應原理的示意圖如下：



試劑盒組份（100次為例）：
LDH釋放試劑——————1.5ml
乳酸溶液———————2ml
酶溶液————————1ml×2
INT溶液(10X)—————0.2ml
INT稀釋液——————2ml

注意事項：
1.冷凍會使樣品中部分乳酸脫氫酶失活，4℃可放置2-3天。建議樣品準備好后盡量當天完成測定。
2.如果檢測細胞培養(yǎng)液中的乳酸脫氫酶，由于血清含有乳酸脫氫酶，建議血清的使用濃度不要超過1%，并使用熱滅活血清。如果一定需要使用10%血清，在檢測時一定要設置沒有細胞，但加入了相同體積培養(yǎng)液的對照孔，以用于消除背景。
3.細胞過度生長、密度過高、離心速度過大、培養(yǎng)箱內(nèi)外溫差過大，都會造成細胞釋放乳酸脫氫酶增加。
4.如果希望進行乳酸脫氫酶活性的絕對定量，用戶需自備乳酸脫氫酶標準品。

儲存條件：-20℃，有效期一年。

使用方法：

一、樣品的準備：
方法一：LDH釋放檢測
a.根據(jù)細胞的大小和生長速度將適量細胞接種到96孔細胞培養(yǎng)板中，使待檢測時細胞密度不超過80-90%滿。
b.吸去培養(yǎng)液，用PBS液洗滌一次。換新鮮培養(yǎng)液(推薦使用含1%血清的低血清培養(yǎng)液或適當?shù)臒o血清培養(yǎng)液)，將各培養(yǎng)孔分成如下幾組：包括無細胞的培養(yǎng)液孔(背景空白對照孔)，未經(jīng)藥物處理的對照細胞孔(樣品對照孔)，未經(jīng)藥物處理的用于后續(xù)裂解的細胞孔(樣品酶活性對照孔)，以及藥物處理的細胞孔(藥物處理樣品孔)，并做好標記。按照實驗需要給予適當藥物處理(如加入0-10μl左右特定的藥物刺激，可設置不同濃度，不同處理時間，對照孔中需加入適當?shù)乃幬锶軇φ?，繼續(xù)按常規(guī)培養(yǎng)。到預定的檢測時間點前1小時，從細胞培養(yǎng)箱里取出細胞培養(yǎng)板，在“樣品酶活性對照孔”中加入試劑盒提供的LDH釋放試劑，加入量為原有培養(yǎng)液體積的10%。加入LDH釋放試劑后，反復吹打數(shù)次混勻，然后繼續(xù)在細胞培養(yǎng)箱中孵育。
c.到達預定時間后，將細胞培養(yǎng)板用多孔板離心機400g離心5min。分別取各孔的上清液120μl，加入到一新的96孔板相應孔中，隨即進行樣品測定。
方法二：細胞內(nèi)總LDH的檢測
a.細胞毒性檢測：根據(jù)細胞的大小和生長速度將適量細胞接種到96孔細胞培養(yǎng)孔板中，使待檢測時細胞密度不超過80-90%滿。加入不同藥物進行處理，并設置適當對照。藥物刺激完畢后，將細胞培養(yǎng)板用多孔板離心機400g離心5min。盡量吸除上清，加入150μl 用PBS稀釋了10倍的試劑盒提供的LDH釋放試劑(10體積PBS中加入1體積LDH釋放試劑并混勻)，適當搖晃培養(yǎng)板混勻，然后繼續(xù)在細胞培養(yǎng)箱中孵育1小時。隨后將細胞培養(yǎng)板用多孔板離心機400g離心5min。分別取各孔的上清液120μl，加入到一新的96孔板相應孔中，隨即進行樣品測定。
b.細胞增殖檢測：根據(jù)細胞的大小和生長速度將適量細胞接種到96孔細胞培養(yǎng)孔板中，使促進細胞增殖的藥物刺激后細胞不超過80-90%滿為宜。使用不同的藥物刺激細胞，并設置適當對照。藥物刺激完畢后，將細胞培養(yǎng)板用多孔板離心機400g離心5min。盡量吸除上清，加入150μl 用PBS稀釋了10倍的試劑盒提供的LDH釋放試劑(10體積PBS中加入1體積LDH釋放試劑并混勻)，適當搖晃混勻，然后繼續(xù)在細胞培養(yǎng)箱中孵育1小時。隨后將細胞培養(yǎng)板用多孔板離心機400g離心5min。分別取各孔上清液120μl，加入到一新的96孔板相應孔中，隨即進行樣品測定。
  注：LDH釋放檢測更加常用一些，細胞內(nèi)總LDH檢測通?？梢允褂肕TT、WST-1或CCK-8等方法替代。

二、試劑盒的準備工作：
a.INT溶液(1X)的配制：根據(jù)所需的INT溶液(1X)的量，取適量INT溶液(10X)用INT稀釋液稀釋至1X。例如，取20μl INT溶液(10X)，加入180μl INT稀釋液，混勻后即配置為200μl INT溶液(1X)。INT溶液(1X)宜現(xiàn)配現(xiàn)用，配置后4℃保存可于當天使用，不宜配置后凍存。
b.LDH檢測工作液的配置:根據(jù)待測定的樣品數(shù)(含對照)，參考下表在臨檢測前新鮮配制適量的檢測工作液。
  注意：LDH檢測工作液必須現(xiàn)配現(xiàn)用，配制和使用過程中均要注意適當避光。
  

c.(選做)如果希望進行LDH酶活性的絕對定量，需自備LDH標準品，并新鮮配制不同濃度LDH標準品，如10mU/ml、5mU/ml、2.5mU/ml、1.25mU/ml、0.65mU/ml、0 mU/ml。

三、樣品測定：
a.各孔分別加入60μl LDH檢測工作液。
b.混勻，室溫(約25℃)避光孵育30min(可用鋁箔包裹后置于水平搖床或側擺搖床上緩慢搖動)。然后在490nm處測定吸光度。使用600nm或大于600nm的任一波長作為參考波長進行雙波長測定。
c.計算(測得的各組吸光度均應減去背景空白對照孔吸光度)
d.細胞毒性或死亡率(%)=(處理樣品吸光度－樣品對照孔吸光度)/(細胞酶活性的吸光度－樣品對照孔吸光度)×100
e.可繪制細胞毒性曲線：縱座標為實際吸光度，橫坐標為藥物濃度；據(jù)此可計算該藥物作用特定時間的半致死劑量LD50。

附錄1：
可同時測定一已知濃度的LDH酶標準品對應的吸光度值，參考以下公式粗略計算出樣品中LDH酶活力：
待測樣品中LDH活力單位(mU/ml)＝(樣品孔吸光度－背景空白對照孔吸光度)/(標準管吸光度－標準空白管吸光度)×標準品濃度(mU/ml)；
根據(jù)計算結果可以比較不同樣品處理組間有無統(tǒng)計學差異等。

附錄2：
若需準確計算出LDH酶活性的絕對活性，可通過一系列LDH標準品及相應測得的吸光度值繪制標準曲線，通過標準曲線相應公式計算出樣品中LDH的酶活性。
各孔數(shù)值減去空白對照后，以檢測的吸光度(OD490)為縱坐標，LDH酶活力(mU)為橫坐標，繪制LDH標準曲線。同時計算出該趨勢線的公式。

特別提示：本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！