XTT細(xì)胞增殖與細(xì)胞毒性檢測試劑盒

中文名稱：XTT細(xì)胞增殖與細(xì)胞毒性檢測試劑盒

英文名稱：XTT Cell Proliferation And Cytotoxicity Detection Kit

產(chǎn)品規(guī)格：500次

XTT能被活細(xì)胞里的線粒體脫氫酶降解而產(chǎn)生橙黃色水溶性的甲臜，通過測定甲臜的光譜吸收，進而可以測定細(xì)胞的增殖情況。XTT與MTT同屬四唑氮衍生物，它們檢測細(xì)胞活性的反應(yīng)原理相似，原理圖如下：


產(chǎn)品特點：
1．盒靈敏度，可檢測低細(xì)胞密度樣品，檢測結(jié)果的重復(fù)性優(yōu)于MTT。
2．操作簡便、快捷?？芍苯蛹尤氲綑z測平板。在96-孔板中檢測時，無需洗滌或收獲細(xì)胞，免去溶解步驟。
3．無放射性。不需要配制液閃混合物，也不需要處理廢棄物。
4．與MTT相比，使用更安全。不需要使用揮發(fā)性的有機溶劑來溶解甲基產(chǎn)物。

試劑盒組成：

儲存條件：低溫運輸、-20℃保存(但溶液B也可以常溫運輸和保存)，有效期一年。

使用方法：
下面操作是檢測細(xì)胞毒性的試驗，其他應(yīng)用跟此類似或更簡單(如生長曲線試驗)，操作步驟可以以此為基礎(chǔ)稍作修改即可，故不再贅述。

㈠、接種細(xì)胞
1．按常規(guī)胰酶消化法消化匯合的單層細(xì)胞，收集到含血清的培養(yǎng)基中。
2．200g離心5分鐘收集細(xì)胞沉淀。
3．用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，制備成單細(xì)胞懸浮液并計數(shù)。
4．將細(xì)胞稀釋到2.5×103個/mL～5×10個/mL之間(需要根據(jù)細(xì)胞的生長速度決定)，如果不知道生長數(shù)度，一般可以稀釋到1×10個/mL。
5．將足夠量的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中(便于用排槍取樣)。一個96孔板的MTT檢測需要約20mL的細(xì)胞懸液。
6．用排槍在96孔板除的第2-11列各孔正中央加入200μL細(xì)胞懸液(對正常細(xì)胞)。如果是腫瘤細(xì)胞，則加入100μL腫瘤細(xì)胞懸液和100μL培養(yǎng)基(總體積為200μL)。
 注意：一定要把細(xì)胞加在孔的正中，否則細(xì)胞會聚集在孔的角落處，影響試驗。
7．用排槍在96孔板除的第1和第12各孔中加入跟細(xì)胞懸液等體積的培養(yǎng)基。第1 列各孔將作為+培養(yǎng)基-細(xì)胞+MTT對照(用于測OD時調(diào)零)，第12列加培養(yǎng)基的作用是減少邊緣效應(yīng)對第11列反應(yīng)的影響。
8．按常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法在37℃和5% CO2條件下孵育1-3天，使細(xì)胞進入指數(shù)生長期。

㈡、藥物處理
9．用培養(yǎng)基將藥物稀釋到8個待測濃度(如果不知道待測濃度，則需要預(yù)試驗確定)，一般一種藥物需要做3塊平行板。
10．去除第2到第11列(共10列)各孔中的培養(yǎng)基(不要觸動細(xì)胞)，保留第1 列和第12列各孔中的培養(yǎng)基。
11．在第2和第11列(共2列)的各孔中加入200μL新鮮培養(yǎng)基，這些孔將作為+培養(yǎng)基+細(xì)胞-藥物的對照。
12．在第3到第10列(共8列)各孔中加入8個濃度梯度的待測藥物，每列加入一個濃度的藥物。
13．按常規(guī)方法把96孔板繼續(xù)放在37℃和5% CO2條件下孵育一定的時間，此段時間即為藥物處理細(xì)胞的時間，由用戶自己決定。
14．處理結(jié)束后去除第2到第11列(共10列，均含細(xì)胞)所有孔中的培養(yǎng)基，并再加入100μL新鮮培養(yǎng)基。
15．每天換培養(yǎng)使細(xì)胞數(shù)量擴增2-3倍(所需時間隨細(xì)胞不同而不同)。

㈢、存活細(xì)胞計數(shù)
16．在生長末期，去除第1到第11列各孔中的培養(yǎng)基后，再加入100μL新鮮培養(yǎng)基和10μL溶液A(含MTT成分)，用錫箔包裹住96孔板后放在37℃和5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)4-8小時。
 注意：溶液A在低溫情況下會凝固，使用前請室溫放置或20-25℃水浴至全部溶解，搖勻后使用。MTT有致癌性，一定要帶手套操作。
17．小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基(含溶液A)。由于培養(yǎng)基可能會影響光吸收，盡可能去除。
18．每孔加入100μL溶液B，置搖床上低速振蕩10分鐘，使MTT形成的formazan結(jié)晶物充分溶解。
19．由于產(chǎn)物不穩(wěn)定，故需要立即在酶聯(lián)免疫檢測儀上選擇490nm測定吸光度。
 注意：用第1 列各孔(+培養(yǎng)基-細(xì)胞+MTT對照)調(diào)零。
20．計數(shù)同樣處理的各次重復(fù)的平均值。
21．以藥物濃度為橫軸，以吸光度為縱軸繪制曲線。由于各處理吸光度絕對值差別很大，一般需將其轉(zhuǎn)化成生長抑制率(以不加藥物的第2和第11列各孔數(shù)據(jù)的平均數(shù)作為100%)，這樣便于計算出IC50，用于各種藥物處理效果的比較。
 注意：如果測生長曲線，則以時間為橫軸。正常生長曲線一般呈現(xiàn)S型，具有促進作用的則斜率加大。

特別提示：本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！