紐蛋白(VCL) 檢測試劑盒( ELISA 方法)?
需自備的設(shè)備及試劑
450±10nm濾光片的酶標(biāo)儀(建議儀器使用前提前預(yù)熱) 單道或多道微量加液器及吸頭 稀釋樣品的EP管 蒸餾水或去離子水 吸水紙 盛放洗液的容器 試劑盒的儲存及有效期
未開封的試劑盒:所有試劑均按試劑瓶標(biāo)簽上所示保存。請注意,收到試劑盒后請盡快將TMB 洗滌液,終止液保存于4℃,其他試劑保存于-20℃。 使用后的試劑盒:剩余試劑仍需按照試劑瓶標(biāo)簽所示的溫度保存,開封后的酶標(biāo)板要加干燥劑后密封保存于-20℃,避免潮濕。 穩(wěn)定性 經(jīng)測定,試劑盒在有效期內(nèi)按推薦溫度保存,其活性降低率小于5%。 為減小外部因素對試劑盒破壞前后檢測值的影響,實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境條件需盡量保持一致,尤其是實(shí)驗(yàn)室內(nèi)溫度、濕度及溫育條件。其次由同一實(shí)驗(yàn)員來進(jìn)行操作可減少人為誤差。 注意: 試劑盒內(nèi)酶標(biāo)條可拆卸,按實(shí)驗(yàn)需求可分多次使用;使用后的剩余試劑盒建議在首次實(shí)驗(yàn)后 1個月內(nèi)使用完畢。產(chǎn)品過期時間以盒子上的標(biāo)簽為準(zhǔn),保質(zhì)期內(nèi)所有組分都確保是穩(wěn)定的。 圖1. 雙抗體夾心ELISA原理圖。 一個包裝的本試劑盒,包括標(biāo)準(zhǔn)品檢測,可以進(jìn)行96次檢測。 保存條件: 除標(biāo)準(zhǔn)品外,4℃保存6個月內(nèi)有效。標(biāo)準(zhǔn)品4℃保存,1-2周內(nèi)有效,-20℃保存6個月內(nèi)有效。 注意事項: 由于標(biāo)準(zhǔn)品一般是凍干粉,在制備后需要嚴(yán)格校準(zhǔn),所以標(biāo)準(zhǔn)品的瓶數(shù)及每瓶標(biāo)準(zhǔn)品所需加入的稀釋液體積請以實(shí)際收到的試劑盒及標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)簽上的標(biāo)注為準(zhǔn)。 洗滌液(20X)在低溫下可能有結(jié)晶,如果發(fā)現(xiàn)有結(jié)晶,請室溫水浴加熱使結(jié)晶完全溶解后再配制工作液。 為保證標(biāo)準(zhǔn)品的精確性,標(biāo)準(zhǔn)品配制使用后,如果有剩余請勿再次使用。 TMB對人體有刺激性,操作時請小心,并注意適當(dāng)防護(hù)以避免直接接觸人體或吸入體內(nèi)。 加樣時,請注意每個樣品或標(biāo)準(zhǔn)品必須更換槍頭,一方面避免交叉污染,另一方面也避免吸取體積的誤差。 不宜混用不同批號的試劑盒組份,每批次試劑盒均經(jīng)過獨(dú)立測試。 充分混勻?qū)ΡWC反應(yīng)結(jié)果的精準(zhǔn)性很重要,在加液后請輕輕晃動整個96孔板,以保證混勻。 本試劑盒很多操作在室溫進(jìn)行,要求嚴(yán)格控制室溫在25-28℃。溫度低于25℃會導(dǎo)致最終檢測到的吸光度顯著下降。 洗滌過程非常重要,洗滌不充分會使精確度下降并導(dǎo)致結(jié)果誤差較大。 檢測標(biāo)準(zhǔn)品和樣品時建議設(shè)置重復(fù)孔,以確保檢測結(jié)果的可信度。 加樣過程中須避免氣泡的產(chǎn)生。 本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用,不得用于臨床診斷或治療,不得用于食品或藥品,不得存放于普通住宅內(nèi)。 為了您的安全和健康,請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。 使用說明: 1. 樣品準(zhǔn)備 a. 樣品的準(zhǔn)備請按下列流程進(jìn)行操作: (a) 細(xì)胞上清樣品離心取上清即可(如100-500g,5分鐘)。 (b) 對于血清樣品,將全血在室溫放置30分鐘至2小時,不要劇烈搖晃以免溶血,待全血自然凝固并析出血清后,4℃約1000-2000g離心10分鐘,取黃色上清即得血清,注意不要吸取白色或淡黃色沉淀。制備好的血清需置于冰上待用。 (c) 對于血漿樣品,采集的全血使用肝素或者EDTA進(jìn)行抗凝處理,混勻后置冰上,4℃約1000-2000g離心10分鐘,取黃色或淡黃色上清即得血漿,注意不要吸取白色沉淀。制備好的血漿需置于冰上待用。 (d) 若待測樣品不能及時檢測,樣品制備后請分裝,凍存于-20℃或-80℃,并注意避免反復(fù)凍融。 b. 血清樣品不應(yīng)添加任何防腐劑或抗凝劑。 c. 樣品應(yīng)清澈透明,檢測前樣品中如有懸浮物應(yīng)通過離心去除。 d. 請勿使用溶血、高血脂或污染的樣品檢測,否則結(jié)果將不準(zhǔn)確。 注:血清或血漿樣品可能需要用樣品分析緩沖液適當(dāng)稀釋后再檢測。 2. 檢測前準(zhǔn)備工作 a. 試劑盒從冰箱中取出后應(yīng)置室溫(25-28℃)平衡20分鐘;每次檢測后剩余試劑請及時置于4℃保存。 b. 配制適當(dāng)量的洗滌液:將洗滌液(20X)用雙蒸水或去離子水稀釋至1X,例如10ml洗滌液(20X)加190ml水混勻后即為1X的洗滌液。 c. 按標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)簽上標(biāo)注的體積加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液至1瓶標(biāo)準(zhǔn)品中,室溫孵育15分鐘(為確保標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確性,切勿縮短孵育時間)。隨后輕輕混勻并用移液槍吹打幾次使標(biāo)準(zhǔn)品徹底溶解,使標(biāo)準(zhǔn)品終濃度達(dá)到4000pg/ml。通常每個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品需要檢測2個孔,每個孔的標(biāo)準(zhǔn)品用量為100μl,共需200μl,同時稀釋時還需要使用250μl,因此如果1瓶標(biāo)準(zhǔn)品配制后的體積不足0.45ml,請使用更多瓶數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品,并在合并混勻后使用。 d. 取5個潔凈的1.5毫升離心管,每管預(yù)先加入250μl的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液,并參考圖2進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的倍比稀釋,最終得到4000、2000、1000、500、250、125pg/ml共六個標(biāo)準(zhǔn)品濃度,最后將稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品依次加入預(yù)包被板孔中,標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液直接加入作為0pg/ml濃度,共七個標(biāo)準(zhǔn)品濃度。
ELISA實(shí)驗(yàn)因靈敏度高,特異性強(qiáng)在生物科研上得到了廣泛的認(rèn)可,但對初學(xué)者而言,如不注意實(shí)驗(yàn)操作過程中的各個環(huán)節(jié),可能會對最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生比較大的影響,比如實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)白板,顯色弱靈敏度低,花板無梯度背景高等現(xiàn)象。下面對以上實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象進(jìn)行一一解析。 1.白板現(xiàn)象 在完成所有實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行底物TMB溶液顯色后,酶標(biāo)板中所有孔的顏色均為無色,即無信號呈現(xiàn)。 出現(xiàn)該現(xiàn)象的可能原因: a.試劑已過保質(zhì)期,不同批次稀釋液交叉使用。 b.錯加漏加檢測A,檢測B或者底物溶液TMB。 c.洗板或者加樣過程中,酶標(biāo)記物被污染失活,稀釋液中含有酶抑制劑如疊氮吶等。 d.配置稀釋液的蒸餾水可能被污染。 e.洗滌液是濃縮型的,沒有按比例進(jìn)行稀釋。 f.酶標(biāo)記物的活性和效價比較低。 g.溶液的PH值不正確,一般稀釋液的PH值應(yīng)保持在7.2-7.4。 2.顯色弱靈敏度低 在完成所有實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行底物TMB溶液顯色后,酶標(biāo)板中孔的顯色比較淺,即只有微弱的信號呈現(xiàn)。 出現(xiàn)該現(xiàn)象的可能原因: a.產(chǎn)品過有效期,試劑沒有按規(guī)定進(jìn)行適當(dāng)?shù)谋4妗?br /> b.試劑,標(biāo)準(zhǔn)品或者樣品在使用前沒有平衡到室溫。 c.少加了試劑的量或者加入試劑的稀釋比例不當(dāng)。 d.洗板或者加樣過程中,酶標(biāo)物受污染失活。 e.孵育時間和孵育溫度未達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。 f.洗滌液稀釋倍數(shù)不符合要求,洗板次數(shù)過多,洗板沖擊力過大,洗板浸泡時間過長。 g.底物溶液TMB顯色時間太短。 3.花板無梯度背景高 在完成所有實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行底物TMB溶液顯色后,酶標(biāo)板中的孔有顏色但沒有梯度,背景也可能較高. 出現(xiàn)該現(xiàn)象的可能原因: a.底物溶液TMB未置于陰涼避光處保存,實(shí)驗(yàn)前溶液已經(jīng)變藍(lán)。 b.孵育溫度過高或者孵育時間過長,發(fā)生了較強(qiáng)的非特異性吸附。 c.沒有按說明書要求洗板,特別是洗板時洗滌液的量少加了。 d.加樣時沒有換槍頭造成交叉污染。 e.花板現(xiàn)象:低濃度或者低活性的包被抗體或者檢測抗體,封閉不足導(dǎo)致的本底不穩(wěn)定,洗板不充分,包被板子的問題。 綜上所述:在ELISA實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意以下問題: 1.在實(shí)驗(yàn)前應(yīng)該按相關(guān)要求將實(shí)驗(yàn)試劑平衡至室溫。 2.包被抗體和檢測抗體應(yīng)該是有高活性的且都針對同一抗原。 3.試劑保存:蛋白抗體類試劑保存于-20攝氏度,顯色液洗滌液保存于2-8攝氏度。 4.各試劑在使用前應(yīng)充分混勻,以保證試劑的均一性和準(zhǔn)確性。 5.嚴(yán)格控制反應(yīng)溫度和反應(yīng)試劑。 6.洗板次數(shù),洗板液的量,洗板液浸泡時間的長短,洗板的力度都是應(yīng)該注意的問題。 7.相關(guān)濃縮液應(yīng)按要求稀釋到相應(yīng)比例方可使用,PH值要保持在7.2-7.4之間。 8.在終止反應(yīng)時盡量避免微孔中存有氣泡。 9.終止反應(yīng)完成后應(yīng)該在2min內(nèi)完成酶標(biāo)儀讀數(shù)。 特別提示:本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實(shí)驗(yàn),嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途!
上??道噬锟萍加邢薰?/span>
聯(lián)系商家時請?zhí)峒癱hemicalbook,有助于交易順利完成!
上??道噬?/p>