Human TNF-β ELISA Kit

康朗生物的Human TNF-β ELISA Kit (Human Tumor Necrosis Factor-β Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Kit)，即人腫瘤壞死因子β酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒，是一種用于特異性地高靈敏地定量檢測人血清、血漿或細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的TNF-β的ELISA試劑盒。
本產(chǎn)品檢測靈敏度高，特異性強(qiáng)，重復(fù)性好。多次重復(fù)檢測結(jié)果表明，最小檢出量為15.4pg/ml，與人GM-CSF、IL-8、IL-1β、 TNF-α，小鼠TNF-α等均沒有交叉反應(yīng)，板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%。
腫瘤壞死因子β (Tumor Necrosis Factor-β, TNF-β)，又稱淋巴毒素α (Lymphotoxin-alpha,LT-α)，屬于TNF家族成員。人TNF-β分子量為22kDa，與小鼠和大鼠TNF-β具有73%的氨基酸同源性。分泌型TNF-β以同源三聚體形式存在，能夠激活受體TNF RI/TNFRSF1A、TNF RII/TNFRSF1B和HVEM/TNFRSF14。TNF-β還能夠與LT-β形成異質(zhì)三聚體，激活受體LT-βR/TNFRSF3。TNF-β與受體結(jié)合后能夠?qū)δ[瘤細(xì)胞產(chǎn)生一定的細(xì)胞毒性作用，除此之外還能夠影響淋巴結(jié)的發(fā)育、調(diào)節(jié)淋巴結(jié)在炎癥反應(yīng)和免疫過程當(dāng)中的功能。TNF-β主要表達(dá)在活化的T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞上，對自身免疫性疾病具有一定的生物學(xué)效應(yīng)。
      本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法(Sandwich ELISA)檢測樣品中人TNF-β的濃度，其原理見圖1。人TNF-β特異的單克隆捕獲抗體已預(yù)包被于酶標(biāo)板上，當(dāng)加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品時，其中的人TNF-β會與捕獲抗體結(jié)合。當(dāng)加入生物素化的抗人TNF-β抗體后，生物素化抗人TNF-β抗體與人TNF-β結(jié)合，形成夾心的免疫復(fù)合物。隨后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記Streptavidin (HRP-Streptavidin)，由于生物素與鏈霉親和素(Streptavidin)可以特異性地結(jié)合，因此鏈霉親和素連接的HRP就會與夾心的免疫復(fù)合物連接起來而被固相捕獲。最后加入顯色劑TMB溶液，固相捕獲的辣根過氧化物酶就會催化無色的顯色劑氧化成藍(lán)色物質(zhì)，在加入終止液后呈黃色。通過酶標(biāo)儀檢測450nm處的吸光度值就能實現(xiàn)定量檢測。人TNF-β濃度與A450值呈正比，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對照樣品吸光度值，即可計算出樣品中人TNF-β濃度。

圖1. 雙抗體夾心ELISA原理圖。

一個包裝的本試劑盒，包括標(biāo)準(zhǔn)品檢測，可以進(jìn)行96次檢測。
保存條件：
標(biāo)準(zhǔn)品4℃保存，1-2周內(nèi)有效，-20℃保存6個月內(nèi)有效；試劑盒其它組分4℃保存6個月內(nèi)有效。除標(biāo)準(zhǔn)品外，試劑盒其它組分嚴(yán)禁凍存。
注意事項：
由于標(biāo)準(zhǔn)品一般是凍干粉，在制備后需要嚴(yán)格校準(zhǔn)，所以標(biāo)準(zhǔn)品的瓶數(shù)及每瓶標(biāo)準(zhǔn)品所需加入的稀釋液體積請以實際收到的試劑盒及標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)簽上的標(biāo)注為準(zhǔn)。
洗滌液(20X)在低溫下可能有結(jié)晶，如果發(fā)現(xiàn)有結(jié)晶，請室溫水浴加熱使結(jié)晶完全溶解后再配制工作液。
為保證標(biāo)準(zhǔn)品的精確性，標(biāo)準(zhǔn)品配制使用后，如果有剩余請勿再次使用。
TMB溶液請勿接觸氧化劑和金屬，否則容易失效。
加樣時，請注意每個樣品或標(biāo)準(zhǔn)品必須更換槍頭，一方面避免交叉污染，另一方面也避免吸取體積的誤差。
由于本試劑盒均經(jīng)過獨(dú)立測試，所以請勿混用不同貨號和不同批次的試劑盒組分，即使是同種試劑盒不同批次的試劑盒組分也不能混用。多個試劑盒同時檢測時，請獨(dú)立使用各個試劑盒中的試劑，請勿使用不同試劑盒中相同名稱的組分。
充分混勻?qū)ΡＷC反應(yīng)結(jié)果的精準(zhǔn)性很重要，在加液后請輕輕晃動整個96孔板，以保證混勻。
本試劑盒很多操作在室溫進(jìn)行，要求嚴(yán)格控制室溫在25-28℃。溫度低于25℃會導(dǎo)致最終檢測到的吸光度顯著下降。
洗滌過程非常重要，洗滌不充分會使精確度下降并導(dǎo)致結(jié)果誤差較大。
檢測標(biāo)準(zhǔn)品和樣品時建議設(shè)置重復(fù)孔，以確保檢測結(jié)果的可信度。
加樣過程中須避免氣泡的產(chǎn)生。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用說明：
1.樣品準(zhǔn)備
a. 樣品的準(zhǔn)備請按下列流程進(jìn)行操作：
(a)細(xì)胞上清樣品離心取上清即可(如100-500g，5分鐘)。
(b)對于血清樣品，將全血在室溫下放置30分鐘至2小時，不要劇烈搖晃以免溶血，待全血自然凝固并析出血清后，4℃約1000-2000g離心10分鐘，取黃色上清即得血清，注意不要吸取白色或淡黃色沉淀。制備好的血清需置于冰上待用。
(c)對于血漿樣品，采集的全血建議使用EDTA進(jìn)行抗凝處理，混勻后置冰上，4℃約1000-2000g離心10分鐘，取黃色或淡黃色上清即得血漿，注意不要吸取白色沉淀。制備好的血漿需置于冰上待用。
(d)若待測樣品不能及時檢測，樣品制備后請分裝，凍存于-20℃或-80℃，并注意避免反復(fù)凍融。
b.血清樣品不應(yīng)添加任何防腐劑或抗凝劑。
c.樣品應(yīng)清澈透明，檢測前樣品中如有懸浮物應(yīng)通過離心去除。
d.請勿使用溶血、高血脂或污染的樣品檢測，否則結(jié)果將不準(zhǔn)確。
注：血清或血漿樣品需要用1X標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液適當(dāng)稀釋后再檢測。
2.檢測前準(zhǔn)備工作
a.試劑盒從冰箱中取出后應(yīng)置室溫(25-28℃)平衡20分鐘；每次檢測后剩余試劑請及時置于4℃保存。
b.配制適當(dāng)量的洗滌液：將洗滌液(20X)用雙蒸水或去離子水稀釋至1X，例如10ml洗滌液(20X)加190ml水混勻后即為1X的洗滌液。
c.按標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)簽上標(biāo)注的體積加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液至1瓶標(biāo)準(zhǔn)品中，室溫孵育15分鐘(為確保標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確性，切勿縮短孵育時間)。隨后輕輕混勻并用移液槍吹打幾次使標(biāo)準(zhǔn)品徹底溶解，使標(biāo)準(zhǔn)品終濃度達(dá)到2000pg/ml。通常每個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品需要檢測2個孔，每個孔的標(biāo)準(zhǔn)品用量為100μl，共需200μl，同時稀釋時還需要使用250μl，因此如果1瓶標(biāo)準(zhǔn)品配制后的體積不足0.45ml，請使用更多瓶數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品，并在合并混勻后使用。
d.取5個潔凈的1.5毫升離心管，每管預(yù)先加入250μl的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，并參考圖2進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的倍比稀釋，最終得到2000、1000、500、250、125、62.5pg/ml共六個標(biāo)準(zhǔn)品濃度，最后將稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品依次加入預(yù)包被板孔中，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液直接加入作為0pg/ml濃度，共七個標(biāo)準(zhǔn)品濃度。

圖2. 標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋示意圖。按標(biāo)準(zhǔn)品(STANDARD)標(biāo)簽上標(biāo)注體積加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液溶解并混勻后的濃度為標(biāo)準(zhǔn)品的起始濃度。其它的倍比稀釋后的濃度依次為起始濃度的1/2、1/4、1/8、1/16和1/32。
3.洗滌方法
自動洗板機(jī)或手工洗板：每孔洗滌液為300μl，注入與吸出間隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后將板倒扣在厚吸水紙上適當(dāng)用力拍干。
4.實驗過程需自備的材料和儀器
a.不同規(guī)格的移液槍及相應(yīng)的吸頭
b.酶標(biāo)儀
c.自動洗板機(jī)(如果沒有也可以手工洗板)
d.去離子水或雙蒸水
5.操作步驟
a.計算并確定一次實驗所需的預(yù)包被板條數(shù)，取出所需板條放置在96孔框架內(nèi)，暫時用不到板條請放回鋁箔袋密封，保存于4℃。
b.每次實驗都需配制標(biāo)準(zhǔn)品并繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時建議設(shè)置本底較正孔，即空白孔，設(shè)置方法為該孔只加TMB溶液和終止液。
c.分別將樣品或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品按照100μl/孔加入相應(yīng)孔中，用封板膜(透明)封住反應(yīng)孔，室溫孵育120分鐘。對于血清或血漿樣品的TNF-β的檢測，不同樣品稀釋比例有所區(qū)別，一般范圍在1-10倍，如無明確稀釋范圍，建議從2倍開始稀釋，加樣稀釋時，請先加入樣品分析緩沖液50μl/孔，再加入50μl用1X標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液稀釋后的樣品。如果樣品濃度過高超出檢測范圍，請加大稀釋倍數(shù)后重新檢測。請注意記錄好樣品的稀釋倍數(shù)。
注意：請先查閱相關(guān)文獻(xiàn)確定樣品中待檢測蛋白的大致濃度，如果該濃度大于或者小于本試劑盒的最高或者最低標(biāo)準(zhǔn)品濃度，請適當(dāng)稀釋或濃縮后再進(jìn)行檢測。
d.洗板5次，且最后一次置于厚吸水紙上拍干。
e.加入生物素化抗體100μl/孔(注：此生物素化抗體已經(jīng)預(yù)先配制好，可以直接使用，不必再進(jìn)行稀釋)。用封板膜(透明)封住反應(yīng)孔，室溫孵育60分鐘。
f.洗板5次，且最后一次置于厚吸水紙上拍干。
g.加入辣根過氧化物酶標(biāo)記Streptavidin 100μl/孔(注：此辣根過氧化物酶標(biāo)記Streptavidin已經(jīng)預(yù)先配制好，可以直接使用，不必再進(jìn)行稀釋)。用封板膜(白色)封住反應(yīng)孔，室溫避光孵育20分鐘。室溫偏低時(低于25℃)，需要適當(dāng)延長孵育時間。
h.洗板5次，且最后一次置于厚吸水紙上拍干。
i.加入顯色劑TMB溶液100μl/孔，用封板膜(白色)封住反應(yīng)孔，室溫避光孵育15-20分鐘。室溫偏低時需要適當(dāng)延長孵育時間，此時可以孵育至標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)非常顯著的顏色變化，若樣本濃度足夠高也會出現(xiàn)顯著的顏色變化。
j.加入終止液50μl/孔，混勻后立即測量A450值。
6.結(jié)果分析
a.復(fù)孔的值通常在20%的差異范圍內(nèi)結(jié)果才有效，復(fù)孔平均值可作為測量值。
b.每個標(biāo)準(zhǔn)品或樣品的吸光度值應(yīng)減去本底校正孔的吸光度值(如果沒有做校正孔，則不需要減去)。
c.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，A450值為縱坐標(biāo)，以平滑線連接各標(biāo)準(zhǔn)品的坐標(biāo)點。通過樣品的吸光度值和標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品的相應(yīng)濃度。

圖3. Human TNF-β ELISA Kit的標(biāo)準(zhǔn)曲線。實測數(shù)據(jù)會因?qū)嶒灄l件、檢測儀器等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。
d.若樣品OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重新測定，計算濃度時需注意乘以樣品的稀釋倍數(shù)。

特別提示：本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！