Mouse/Rat TGF-β1 ELISA Kit

康朗生物的Mouse/Rat TGF-β1 ELISA Kit (Mouse/Rat Transforming Growth Factor-β1 Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Kit)，即小鼠/大鼠轉(zhuǎn)化生長因子β1酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒，是一種用于特異性地高靈敏地定量檢測小鼠或大鼠血清、血漿或細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的TGF-β1的ELISA試劑盒。
本產(chǎn)品檢測靈敏度高，特異性強(qiáng)，重復(fù)性好。多次重復(fù)檢測結(jié)果表明，最小檢出量為1.8pg/ml，與小鼠TGF-β2、TGF-β3和大鼠TGF-β2、TGF-β3等均沒有交叉反應(yīng)，板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%。由于成熟的大鼠TGF-β1與小鼠TGF-β1具有100%的氨基酸同源性，因此兩種蛋白均能用本試劑盒進(jìn)行檢測。
轉(zhuǎn)化生長因子(Transforming Growth Factor, TGF)是一種多效性細(xì)胞因子，主要有TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3三種類型，其具有調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生、傷口愈合、免疫應(yīng)答、細(xì)胞增殖和分化多種功能。TGF-β家族還包括骨形成蛋白(Bone Morphogenetic Protein, BMP)、生長分化因子(Growth Differentiation Factors, GDFs)和神經(jīng)元營養(yǎng)因子等其他蛋白因子，該家族成員在結(jié)構(gòu)上均能夠形成多個鏈內(nèi)二硫鍵。
TGF-β1的高親和受體是由TGF-β RI和TGF-β RII組成的受體復(fù)合物，TGF-β RI和TGF-β RII都屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶受體家族。TGF-β RII與TGF-β結(jié)合后，就能夠激活并磷酸化TGF-β RI?；罨腡GF-β RI又能激活Smad蛋白，從而調(diào)控轉(zhuǎn)錄過程。TGF-β RI又稱為活化素受體樣激酶(Activin Recptor-like Kinase, ALK-5)，幾乎表達(dá)于所有細(xì)胞表面，其他兩種I型受體，ALK-1和ALK-2也能夠與TGF-βRII搭檔組成TGF-β信號傳遞受體復(fù)合物參與TGF-β信號傳遞。除了TGF-β RI和TGF-β RII，還有第三種TGF-β1受體，TGF-βRIII (β蛋白聚糖或內(nèi)皮糖蛋白)同樣能夠調(diào)控TGF-β功能。TGF-β首先與TβRII結(jié)合，然后募集并磷酸化TβRI，活化的受體隨后磷酸化受體激活型Smads蛋白(R-Smads)，磷酸化后的R-Smads再與輔助型Smads (Co-Smads)結(jié)合，形成異源寡聚體復(fù)合物，隨后進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)目標(biāo)基因。
本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法(Sandwich ELISA)檢測樣品中小鼠/大鼠TGF-β1的濃度，其原理見圖1。小鼠/大鼠TGF-β1特異的單克隆捕獲抗體已預(yù)包被于酶標(biāo)板上，當(dāng)加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品時，其中的小鼠/大鼠TGF-β1會與捕獲抗體結(jié)合。當(dāng)加入生物素化的抗小鼠/大鼠TGF-β1抗體后，生物素化抗小鼠/大鼠TGF-β1抗體與小鼠/大鼠TGF-β1結(jié)合，形成夾心的免疫復(fù)合物。隨后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記Streptavidin(HRP-Streptavidin)，由于生物素與鏈霉親和素(Streptavidin)可以特異性地結(jié)合，因此鏈霉親和素連接的HRP就會與夾心的免疫復(fù)合物連接起來而被固相捕獲。最后加入顯色劑TMB溶液，固相捕獲的辣根過氧化物酶就會催化無色的顯色劑氧化成藍(lán)色物質(zhì)，在加入終止液后呈黃色。通過酶標(biāo)儀檢測450nm處的吸光度值就能實(shí)現(xiàn)定量檢測。小鼠/大鼠TGF-β1濃度與A450值呈正比，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對照樣品吸光度值，即可計(jì)算出樣品中小鼠/大鼠TGF-β1濃度。

圖1. 雙抗體夾心ELISA原理圖。

一個包裝的本試劑盒，包括標(biāo)準(zhǔn)品檢測，可以進(jìn)行96次檢測。
保存條件：
標(biāo)準(zhǔn)品4℃保存，1-2周內(nèi)有效，-20℃保存6個月內(nèi)有效；試劑盒其它組分4℃保存6個月內(nèi)有效。除標(biāo)準(zhǔn)品外，試劑盒其它組分嚴(yán)禁凍存。
注意事項(xiàng)：
由于標(biāo)準(zhǔn)品一般是凍干粉，在制備后需要嚴(yán)格校準(zhǔn)，所以標(biāo)準(zhǔn)品的瓶數(shù)及每瓶標(biāo)準(zhǔn)品所需加入的稀釋液體積請以實(shí)際收到的試劑盒及標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)簽上的標(biāo)注為準(zhǔn)。
洗滌液(20X)在低溫下可能有結(jié)晶，如果發(fā)現(xiàn)有結(jié)晶，請室溫水浴加熱使結(jié)晶完全溶解后再配制工作液。
為保證標(biāo)準(zhǔn)品的精確性，標(biāo)準(zhǔn)品配制使用后，如果有剩余請勿再次使用。
TMB溶液請勿接觸氧化劑和金屬，否則容易失效。
加樣時，請注意每個樣品或標(biāo)準(zhǔn)品必須更換槍頭，一方面避免交叉污染，另一方面也避免吸取體積的誤差。
同種試劑盒不同批號的試劑盒組分不能混用，每批次試劑盒均經(jīng)過獨(dú)立測試。不同試劑盒相同名稱的組分嚴(yán)禁混用，多個試劑盒同時檢測時，注意避免混淆相同名稱不同試劑盒的組分。 
充分混勻?qū)ΡＷC反應(yīng)結(jié)果的精準(zhǔn)性很重要，在加液后請輕輕晃動整個96孔板，以保證混勻。
本試劑盒很多操作在室溫進(jìn)行，要求嚴(yán)格控制室溫在25-28℃。溫度低于25℃會導(dǎo)致最終檢測到的吸光度顯著下降。
洗滌過程非常重要，洗滌不充分會使精確度下降并導(dǎo)致結(jié)果誤差較大。
檢測標(biāo)準(zhǔn)品和樣品時建議設(shè)置重復(fù)孔，以確保檢測結(jié)果的可信度。
加樣過程中須避免氣泡的產(chǎn)生。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
 

使用說明：
1.樣品準(zhǔn)備
a. 樣品的準(zhǔn)備請按下列流程進(jìn)行操作：
(a)細(xì)胞上清樣品離心取上清即可(如100-500g，5分鐘)。
(b)對于血清樣品，將全血在室溫下放置30分鐘至2小時，不要劇烈搖晃以免溶血，待全血自然凝固并析出血清后，4℃約1000-2000g離心10分鐘，取黃色上清即得血清，注意不要吸取白色或淡黃色沉淀。制備好的血清需置于冰上待用。
(c)對于血漿樣品，采集的全血建議使用EDTA進(jìn)行抗凝處理，混勻后置冰上，4℃約1000-2000g離心10分鐘，取黃色或淡黃色上清即得血漿，注意不要吸取白色沉淀。制備好的血漿需置于冰上待用。
(d)若待測樣品不能及時檢測，樣品制備后請分裝，凍存于-20℃或-80℃，并注意避免反復(fù)凍融。
b.血清樣品不應(yīng)添加任何防腐劑或抗凝劑。
c.樣品應(yīng)清澈透明，檢測前樣品中如有懸浮物應(yīng)通過離心去除。
d.請勿使用溶血、高血脂或污染的樣品檢測，否則結(jié)果將不準(zhǔn)確。
注：血清或血漿樣品可能需要用1X標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液倍比稀釋后再檢測
2.檢測前準(zhǔn)備工作
a.試劑盒從冰箱中取出后應(yīng)置室溫(25-28ºC)平衡20分鐘；每次檢測后剩余試劑請及時置于4ºC保存。
b.配制適當(dāng)量的洗滌液：將洗滌液(20X)用雙蒸水或去離子水稀釋至1X，例如10ml洗滌液(20X)加190ml水混勻后即為1X的洗滌液。
c.如有5X標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，請按所需用量將稀釋液(5X)用雙蒸水或去離子水稀釋至1X，例如10ml稀釋液(5X)加40ml水混勻后即為1X的稀釋液。
d.按標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)簽上標(biāo)注的體積加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液至1瓶標(biāo)準(zhǔn)品中，室溫孵育15分鐘(為確保標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確性，切勿縮短孵育時間)。隨后輕輕混勻并用移液槍吹打幾次使標(biāo)準(zhǔn)品徹底溶解，使標(biāo)準(zhǔn)品終濃度達(dá)到2000pg/ml。通常每個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品需要檢測2個孔，每個孔的標(biāo)準(zhǔn)品用量為100μl，共需200μl，同時稀釋時還需要使用250μl，因此如果1瓶標(biāo)準(zhǔn)品配制后的體積不足0.45ml，請使用更多瓶數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品，并在合并混勻后使用。
e.取5個潔凈的1.5毫升離心管，每管預(yù)先加入250μl的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，并參考圖2進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的倍比稀釋，最終得到2000、1000、500、250、125、62.5pg/ml共六個標(biāo)準(zhǔn)品濃度，最后將稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品依次加入預(yù)包被板孔中，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液直接加入作為0pg/ml濃度，共七個標(biāo)準(zhǔn)品濃度。
f.樣品活化和稀釋：生物樣品中的TGF-β1大部分以無活性的復(fù)合物形式存在，檢測前必須活化從而得到有活性的TGF-β1蛋白。本試劑盒提供1N鹽酸溶液進(jìn)行活化，提供1.2N的堿溶液進(jìn)行中和，檢測時必須使用中和后的樣品。標(biāo)準(zhǔn)品無需加酸活化。
細(xì)胞培養(yǎng)上清的活化及稀釋：取100μl樣品，加入20μl 1N的HCl，混勻后室溫孵育10分鐘。隨后再加入20μl 1.2N的NaOH進(jìn)行中和。為了計(jì)算方便，再加入60μl的1X標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，混勻即可，此時樣品相當(dāng)于稀釋了2倍。
血清和血漿樣品的活化及稀釋：取40μl樣品，加入20μl 1N的HCl，混勻后室溫孵育10分鐘。隨后再加入20μl 1.2N 的NaOH進(jìn)行中和。因不同的血清和血漿樣品稀釋比例不一樣，一般稀釋范圍在18-60倍，如無明確范圍，建議從20倍開始稀釋。即在中和后的樣品中加入720μl的1X標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，混勻即可，此時樣品相當(dāng)于稀釋了20倍。

圖2. 標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋示意圖。按標(biāo)準(zhǔn)品(STANDARD)標(biāo)簽上標(biāo)注體積加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液溶解并混勻后的濃度為標(biāo)準(zhǔn)品的起始濃度。其它的倍比稀釋后的濃度依次為起始濃度的1/2、1/4、1/8、1/16和1/32。 

3.洗滌方法
自動洗板機(jī)或手工洗板：每孔洗滌液為300μl，注入與吸出間隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后將板倒扣在厚吸水紙上適當(dāng)用力拍干。
4.實(shí)驗(yàn)過程需自備的材料和儀器
a.不同規(guī)格的移液槍及相應(yīng)的吸頭
b.酶標(biāo)儀
c.自動洗板機(jī)(如果沒有也可以手工洗板)
d.去離子水或雙蒸水
5.操作步驟
a.計(jì)算并確定一次實(shí)驗(yàn)所需的預(yù)包被板條數(shù)，取出所需板條放置在96孔框架內(nèi)，暫時用不到板條請放回鋁箔袋密封，保存于4℃。
b.每次實(shí)驗(yàn)都需配制標(biāo)準(zhǔn)品并繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時建議設(shè)置本底較正孔，即空白孔，設(shè)置方法為該孔只加TMB溶液和終止液。
c.分別將中和并稀釋后的樣品或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品按照100μl/孔加入相應(yīng)孔中，用封板膜(透明)封住反應(yīng)孔，室溫孵育120分鐘。如果檢測時樣品中TGF-β1濃度過高，超過標(biāo)準(zhǔn)曲線最高點(diǎn)，請加大稀釋倍數(shù)后重新稀釋檢測。請注意記錄好樣品的稀釋倍數(shù)。
注意：請先查閱相關(guān)文獻(xiàn)確定樣品中待檢測蛋白的大致濃度，如果該濃度大于或者小于本試劑盒的最高或者最低標(biāo)準(zhǔn)品濃度，請適當(dāng)稀釋或濃縮后再進(jìn)行檢測。
d.洗板5次，且最后一次置于厚吸水紙上拍干。
e.加入生物素化抗體100μl/孔(注：此生物素化抗體已經(jīng)預(yù)先配制好，可以直接使用，不必再進(jìn)行稀釋)。用封板膜(透明)封住反應(yīng)孔，室溫孵育60分鐘。
f.洗板5次，且最后一次置于厚吸水紙上拍干。
g.加入辣根過氧化物酶標(biāo)記Streptavidin 100μl/孔(注：此辣根過氧化物酶標(biāo)記Streptavidin已經(jīng)預(yù)先配制好，可以直接使用，不必再進(jìn)行稀釋)。用封板膜(白色)封住反應(yīng)孔，室溫避光孵育20分鐘。室溫偏低時(低于25℃)，需要適當(dāng)延長孵育時間。
h.洗板5次，且最后一次置于厚吸水紙上拍干。
i.加入顯色劑TMB溶液100μl/孔，用封板膜(白色)封住反應(yīng)孔，室溫避光孵育15-20分鐘。室溫偏低時需要適當(dāng)延長孵育時間，此時可以孵育至標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)非常顯著的顏色變化，若樣品濃度足夠高也會出現(xiàn)顯著的顏色變化。
j.加入終止液50μl/孔，混勻后立即測量A450值。
6.結(jié)果分析
a.復(fù)孔的值通常在20%的差異范圍內(nèi)結(jié)果才有效，復(fù)孔平均值可作為測量值。
b.每個標(biāo)準(zhǔn)品或樣品的吸光度值應(yīng)減去本底校正孔的吸光度值(如果沒有做校正孔，則不需要減去)。
c.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，A450值為縱坐標(biāo)，以平滑線連接各標(biāo)準(zhǔn)品的坐標(biāo)點(diǎn)。通過樣品的吸光度值和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品的相應(yīng)濃度。

圖3. Mouse/Rat TGF-β1 ELISA Kit的標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)測數(shù)據(jù)會因?qū)嶒?yàn)條件、檢測儀器等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。 
d.若樣品OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重新測定，計(jì)算濃度時需注意乘以樣品的稀釋倍數(shù)。

特別提示：本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！