Porcine TNF-α ELISA Kit

康朗生物的Porcine TNF-α ELISA Kit (Porcine Tumor Necrosis Factor αEnzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Kit)，即豬腫瘤壞死因子α酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒，是一種用于特異性地高靈敏地定量檢測豬血清、血漿或細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的TNF-α的ELISA試劑盒。
本產(chǎn)品檢測靈敏度高，特異性強(qiáng)，重復(fù)性好。多次重復(fù)檢測結(jié)果表明，最小檢出量為26.8pg/ml，與小鼠、大鼠TNF-α以及人的TNF-β等均沒有交叉反應(yīng)，與人的TNF-α有6.3%的交叉反應(yīng)性。板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%。
腫瘤壞死因子α (Tumor Necrosis Factor, TNF-α)，又稱cathectin或TNFSF1A，屬于TNF配體家族成員。TNF-α與TNF-β能夠與相同的細(xì)胞表面受體結(jié)合，并且具有部分相同的生物學(xué)功能。TNF-α能夠抑制部分腫瘤的生長，在正常的抗感染過程中也具有重要作用，是重要的免疫調(diào)節(jié)因子和炎癥反應(yīng)應(yīng)答調(diào)節(jié)因子。在感染性休克和自身免疫疾病等病理?xiàng)l件下，TNF-α的表達(dá)會出現(xiàn)明顯升高。TNF-α主要由活化的巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生分泌。
豬TNF-α基因編碼得到含有232個(gè)氨基酸殘基的II型跨膜糖蛋白，其中包含35個(gè)氨基酸的胞質(zhì)域、21個(gè)氨基酸的跨膜域和178個(gè)氨基酸的胞外域。在TNF-α轉(zhuǎn)化酶的作用下還能夠得到156個(gè)氨基酸殘基的游離TNF-α。具有生物學(xué)活性的TNF-α通常以三聚體的形式存在。豬TNF-α與人和小鼠TNF-α具有89%和79%的氨基酸同源性。
TNF具有兩種受體：I型受體(type B, p55, TNFRSF1A)和II型受體(type A, p75, TNFRSF1B)，兩種受體與TNF-α和TNF-β具有相同的親和力。兩種受體胞外域具有氨基酸序列同源性，而胞質(zhì)域則并不相同，這提示兩種受體在與配體結(jié)合后可能介導(dǎo)不同的信號傳遞通路。TNF-α以三聚體形式與相應(yīng)受體結(jié)合，進(jìn)而引發(fā)其下游信號通路的激活，TNF-α的信號通路圖參見圖1。

圖1. TNF-α的信號通路示意圖。

本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法(Sandwich ELISA)檢測樣品中豬TNF-α的濃度，其原理見圖2。豬TNF-α特異的單克隆捕獲抗體已預(yù)包被于酶標(biāo)板上，當(dāng)加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品時(shí)，其中的豬TNF-α會與捕獲抗體結(jié)合。當(dāng)加入生物素化的抗豬TNF-α抗體后，生物素化抗豬TNF-α抗體與豬TNF-α結(jié)合，形成夾心的免疫復(fù)合物。隨后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記Streptavidin (HRP-Streptavidin)，由于生物素與鏈霉親和素(Streptavidin)可以特異性地結(jié)合，因此鏈霉親和素連接的HRP就會與夾心的免疫復(fù)合物連接起來而被固相捕獲。最后加入顯色劑TMB溶液，固相捕獲的辣根過氧化物酶就會催化無色的顯色劑氧化成藍(lán)色物質(zhì)，在加入終止液后呈黃色。通過酶標(biāo)儀檢測450nm處的吸光度值就能實(shí)現(xiàn)定量檢測。豬TNF-α濃度與A450值呈正比，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對照樣品吸光度值，即可計(jì)算出樣品中豬TNF-α濃度。

圖2. 雙抗體夾心ELISA原理圖。

一個(gè)包裝的本試劑盒，包括標(biāo)準(zhǔn)品檢測，可以進(jìn)行96次檢測。
保存條件：
標(biāo)準(zhǔn)品4℃保存，1-2周內(nèi)有效，-20℃保存6個(gè)月內(nèi)有效；試劑盒其它組份4℃保存6個(gè)月內(nèi)有效。除標(biāo)準(zhǔn)品外，試劑盒其它組份嚴(yán)禁凍存。
注意事項(xiàng)：
由于標(biāo)準(zhǔn)品一般是凍干粉，在制備后需要嚴(yán)格校準(zhǔn)，所以標(biāo)準(zhǔn)品的瓶數(shù)及每瓶標(biāo)準(zhǔn)品所需加入的稀釋液體積請以實(shí)際收到的試劑盒及標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)簽上的標(biāo)注為準(zhǔn)。
洗滌液(20X)在低溫下可能有結(jié)晶，如果發(fā)現(xiàn)有結(jié)晶，請室溫水浴加熱使結(jié)晶完全溶解后再配制工作液。
為保證標(biāo)準(zhǔn)品的精確性，標(biāo)準(zhǔn)品配制使用后，如果有剩余請勿再次使用。
TMB溶液請勿接觸氧化劑和金屬，否則容易失效。
加樣時(shí)，請注意每個(gè)樣品或標(biāo)準(zhǔn)品必須更換槍頭，一方面避免交叉污染，另一方面也避免吸取體積的誤差。
由于本試劑盒均經(jīng)過獨(dú)立測試，所以請勿混用不同貨號和不同批次的試劑盒組分，即使是同種試劑盒不同批次的試劑盒組分也不能混用。多個(gè)試劑盒同時(shí)檢測時(shí)，請獨(dú)立使用各個(gè)試劑盒中的試劑，請勿使用不同試劑盒中相同名稱的組分。
充分混勻?qū)ΡＷC反應(yīng)結(jié)果的精準(zhǔn)性很重要，在加液后請輕輕晃動整個(gè)96孔板，以保證混勻。
本試劑盒很多操作在室溫進(jìn)行，要求嚴(yán)格控制室溫在25-28℃。溫度低于25℃會導(dǎo)致最終檢測到的吸光度顯著下降。
洗滌過程非常重要，洗滌不充分會使精確度下降并導(dǎo)致結(jié)果誤差較大。
檢測標(biāo)準(zhǔn)品和樣品時(shí)建議設(shè)置重復(fù)孔，以確保檢測結(jié)果的可信度。
加樣過程中須避免氣泡的產(chǎn)生。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

使用說明：
1.樣品準(zhǔn)備
a. 樣品的準(zhǔn)備請按下列流程進(jìn)行操作：
(a)細(xì)胞上清樣品離心取上清即可(如100-500g，5分鐘)。
(b)對于血清樣品，將全血在室溫下放置30分鐘至2小時(shí)，不要劇烈搖晃以免溶血，待全血自然凝固并析出血清后，4℃約1000-2000g離心10分鐘，取黃色上清即得血清，注意不要吸取白色或淡黃色沉淀。制備好的血清需置于冰上待用。
(c)對于血漿樣品，采集的全血建議使用EDTA進(jìn)行抗凝處理，混勻后置冰上，4℃約1000-2000g離心10分鐘，取黃色或淡黃色上清即得血漿，注意不要吸取白色沉淀。制備好的血漿需置于冰上待用。
(d)若待測樣品不能及時(shí)檢測，樣品制備后請分裝，凍存于-20℃或-80℃，并注意避免反復(fù)凍融。
b.血清樣品不應(yīng)添加任何防腐劑或抗凝劑。
c.樣品應(yīng)清澈透明，檢測前樣品中如有懸浮物應(yīng)通過離心去除。
d.請勿使用溶血、高血脂或污染的樣品檢測，否則結(jié)果將不準(zhǔn)確。
注：血清或血漿樣品需要用樣品分析緩沖液倍比稀釋后再檢測。
2.檢測前準(zhǔn)備工作
a.試劑盒從冰箱中取出后應(yīng)置室溫(25-28℃)平衡20分鐘；每次檢測后剩余試劑請及時(shí)置于4℃保存。
b.配制適當(dāng)量的洗滌液：將洗滌液(20X)用雙蒸水或去離子水稀釋至1X，例如10ml洗滌液(20X)加190ml水混勻后即為1X的洗滌液。
c.按標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)簽上標(biāo)注的體積加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液至1瓶標(biāo)準(zhǔn)品中，室溫孵育15分鐘(為確保標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確性，切勿縮短孵育時(shí)間)。隨后輕輕混勻并用移液槍吹打幾次使標(biāo)準(zhǔn)品徹底溶解，使標(biāo)準(zhǔn)品終濃度達(dá)到2000pg/ml。通常每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品需要檢測2個(gè)孔，每個(gè)孔的標(biāo)準(zhǔn)品用量為100μl，共需200μl，同時(shí)稀釋時(shí)還需要使用250μl，因此如果1瓶標(biāo)準(zhǔn)品配制后的體積不足0.45ml，請使用更多瓶數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品，并在合并混勻后使用。
d.取5個(gè)潔凈的1.5毫升離心管，每管預(yù)先加入250μl的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，并參考圖3進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的倍比稀釋，最終得到2000、1000、500、250、125、62.5pg/ml共六個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品濃度，最后將稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品依次加入預(yù)包被板孔中，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液直接加入作為0pg/ml濃度，共七個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品濃度。

圖3. 標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋示意圖。按標(biāo)準(zhǔn)品(STANDARD)標(biāo)簽上標(biāo)注體積加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液溶解并混勻后的濃度為標(biāo)準(zhǔn)品的起始濃度。其它的倍比稀釋后的濃度依次為起始濃度的1/2、1/4、1/8、1/16和1/32。
3.洗滌方法
自動洗板機(jī)或手工洗板：每孔洗滌液為300μl，注入與吸出間隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后將板倒扣在厚吸水紙上適當(dāng)用力拍干。
4.實(shí)驗(yàn)過程需自備的材料和儀器
a.不同規(guī)格的移液槍及相應(yīng)的吸頭
b.酶標(biāo)儀
c.自動洗板機(jī)(如果沒有也可以手工洗板)
d.去離子水或雙蒸水
5.操作步驟
a.計(jì)算并確定一次實(shí)驗(yàn)所需的預(yù)包被板條數(shù)，取出所需板條放置在96孔框架內(nèi)，暫時(shí)用不到板條請放回鋁箔袋密封，保存于4℃。
b.每次實(shí)驗(yàn)都需配制標(biāo)準(zhǔn)品并繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)建議設(shè)置本底較正孔，即空白孔，設(shè)置方法為該孔只加TMB溶液和終止液。
c.分別將樣品或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品按照100μl/孔加入相應(yīng)孔中，用封板膜(透明)封住反應(yīng)孔，室溫孵育120分鐘。對于血清或血漿樣品的TNF-α的檢測，請先加入50μl樣品分析緩沖液后再加50μl樣品(注：此時(shí)樣品相當(dāng)于已經(jīng)被稀釋了2倍)；如果樣品濃度過高超出檢測范圍，請先加入50μl樣品分析緩沖液后再加50μl稀釋后的樣品。請注意記錄好樣品的稀釋倍數(shù)。
注意：請先查閱相關(guān)文獻(xiàn)確定樣品中待檢測蛋白的大致濃度，如果該濃度大于或者小于本試劑盒的最高或者最低標(biāo)準(zhǔn)品濃度，請適當(dāng)稀釋或濃縮后再進(jìn)行檢測。
d.洗板5次，且最后一次置于厚吸水紙上拍干。
e.加入生物素化抗體100μl/孔(注：此生物素化抗體已經(jīng)預(yù)先配制好，可以直接使用，不必再進(jìn)行稀釋)。用封板膜(透明)封住反應(yīng)孔，室溫孵育60分鐘。
f.洗板5次，且最后一次置于厚吸水紙上拍干。
g.加入辣根過氧化物酶標(biāo)記Streptavidin 100μl/孔(注：此辣根過氧化物酶標(biāo)記Streptavidin已經(jīng)預(yù)先配制好，可以直接使用，不必再進(jìn)行稀釋)。用封板膜(白色)封住反應(yīng)孔，室溫避光孵育20分鐘。室溫偏低時(shí)(低于25℃)，需要適當(dāng)延長孵育時(shí)間。
h.洗板5次，且最后一次置于厚吸水紙上拍干。
i.加入顯色劑TMB溶液100μl/孔，用封板膜(白色)封住反應(yīng)孔，室溫避光孵育15-20分鐘。室溫偏低時(shí)需要適當(dāng)延長孵育時(shí)間，此時(shí)可以孵育至標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)非常顯著的顏色變化,若樣品濃度足夠高也會出現(xiàn)顯著的顏色變化。
j.加入終止液50μl/孔，混勻后立即測量A450值。
6.結(jié)果分析
a.復(fù)孔的值通常在20%的差異范圍內(nèi)結(jié)果才有效，復(fù)孔平均值可作為測量值。
b.每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品或樣品的吸光度值應(yīng)減去本底校正孔的吸光度值(如果沒有做校正孔，則不需要減去)。
c.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，A450值為縱坐標(biāo)，以平滑線連接各標(biāo)準(zhǔn)品的坐標(biāo)點(diǎn)。通過樣品的吸光度值和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品的相應(yīng)濃度。

圖4. Porcine TNF-α ELISA Kit的標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)測數(shù)據(jù)會因?qū)嶒?yàn)條件、檢測儀器等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。
d.若樣品OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重新測定，計(jì)算濃度時(shí)需注意乘以樣品的稀釋倍數(shù)。

特別提示：本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！