信裕生物的人基因開放閱讀框(ORF)庫(Human Open Reading Frame library)包含約15,000個人基因ORF克隆，其中包括已知的基因約12,000種。本人基因ORF庫的每一種質(zhì)粒都來自于單克隆，并且每一個ORF都經(jīng)過了測序驗證。后續(xù)使用Gateway系統(tǒng)或PCR反應(yīng)即可非常方便地克隆目的基因到新的表達載體中。
      本人基因ORF庫的克隆在供體載體(Donor vector) pDONR223中，其圖譜如圖1所示。

圖1. pDONR223質(zhì)粒圖譜。 pDONR223的全序列信息：pDONR223-seq.txt。

      ORF克隆是指起始密碼子和終止密碼子之間的編碼序列，而不包含mRNA的5’和3’端的非編碼區(qū)(untranslated region, UTR)。本ORF庫是通過mRNA反轉(zhuǎn)錄獲得的編碼蛋白質(zhì)的cDNA，再通過Gateway技術(shù)的BP重組反應(yīng)克隆到pDONR223載體中得到入門載體，其重組位點的序列如圖2所示。為了便于后續(xù)利用Gateway系統(tǒng)添加適當?shù)?’標簽，所有的克隆都無終止密碼子。在信裕生物的人基因ORF庫中，每一個克隆都代表一個獨立的插入序列，隨機挑取克隆測序，準確率為95%，但較長基因克隆準確率略差。

圖2. ORF兩側(cè)的重組序列

      信裕生物的人基因ORF庫提供的是含有相應(yīng)ORF質(zhì)粒的大腸桿菌甘油菌(DH5α)，本產(chǎn)品一套共169 塊96孔板?？寺≥d體為
pDONR223，載體抗性spectinomycin，推薦使用終濃度為50μg/ml。正向測序M13F引物序列為GTAAAACGACGGCCAGT，反向測序T7引物序列為TAATACGACTCACTATAGG。
      人基因開放閱讀框(ORF)庫基因清單請點擊下載。
包裝清單：

保存條件：
      -20℃保存，二年有效。-80℃保存，五年有效。
注意事項：
      pDONR223載體不能直接在細菌或哺乳動物細胞中表達相應(yīng)蛋白，需要重新克隆至相應(yīng)表達載體才能表達。
      本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。使用說明：
1. 根據(jù)所需人基因ORF的名稱，查詢并選取相應(yīng)的96孔板及孔進行菌種的接種培養(yǎng)。
a. 劃平板隨后挑取單克隆培養(yǎng)：取出對應(yīng)的96孔板置于冰上，并在超凈臺內(nèi)進行后續(xù)操作。等菌液稍融化，撕開封口膜，并小心揭開96孔板板蓋，注意不要交叉污染。按照如下方法之一劃平板接種，隨后挑取單克隆接種到含抗生素的LB中培養(yǎng)。
(a) 用鑷子和塑料槍頭操作：鑷子的頂端在70%酒精中蘸一下，并且在酒精燈上略略燒一下，使鑷子的頂端處于無菌狀態(tài)。用鑷子夾取一個無菌的200微升塑料槍頭，蘸取少量DH5α甘油菌，然后把蘸有菌液的塑料槍頭，以盡量和LB平板接近平行的角度，在含50μg/ml spectin omycin的LB平板上連續(xù)作S形或Z形劃動，再用一無菌的200微升塑料槍頭，在原先的劃線上以90或120度角，再在LB平板上連續(xù)作S形或Z形劃動。通常換槍頭重復(fù)操作2-3次即可。37℃倒置培養(yǎng)過夜。
(b) 用接種環(huán)操作：將接種環(huán)在酒精燈上略略燒一下，使接種環(huán)處于無菌狀態(tài)。微冷后，蘸取少量DH5α甘油菌，在含50μg/ml spectinomycin LB平板上連續(xù)作S形或Z形劃動。把接種環(huán)再燒一下，微冷后，在原先的劃線上以90或120度角，再在LB平板上連續(xù)作S形或Z形劃動。通常用接種環(huán)重復(fù)操作2-3次即可。37℃倒置培養(yǎng)過夜。
b. 直接培養(yǎng)：取出對應(yīng)的96孔板置于冰上，并置于超凈臺內(nèi)，后續(xù)操作都在超凈臺內(nèi)操作。把鑷子的頂端在70%酒精中蘸一下，并且在酒精燈上略略燒一下，使鑷子的頂端處于無菌狀態(tài)。用鑷子夾取一個無菌的塑料槍頭或牙簽，蘸取少量DH5α甘油菌，然后把蘸有菌液的塑料槍頭或牙簽放到裝有3毫升含50μg/ml spectinomycin 的LB細菌培養(yǎng)試管內(nèi)或裝有100毫升或更大體積LB的細菌培養(yǎng)瓶內(nèi)。37℃，約200rpm培養(yǎng)過夜。
2. 對于培養(yǎng)的菌液進行質(zhì)粒的小量、中量或大量抽提。
3. 重組或PCR克?。喝嘶騉RF庫的每一個蛋白質(zhì)編碼序列兩端有特異的重組序列。通過LR重組反應(yīng)可以將ORF轉(zhuǎn)移到特定接收載體中，例如Gateway系統(tǒng)的pDEST系列載體等，從而使目的基因在大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞或哺乳細胞等中表達；也可以此ORF庫作為模板用PCR或其它常規(guī)方法克隆到其它蛋白表達載體中用于在細菌、酵母、昆蟲細胞或哺乳動物細胞等中的表達