化學(xué)發(fā)光法EMSA試劑盒

化學(xué)發(fā)光法EMSA試劑盒(Chemiluminescent EMSA Kit)是一種通過Streptavidin-HRP及后續(xù)的BeyoECL Moon試劑來實現(xiàn)化學(xué)發(fā)光檢測Biotin標(biāo)記的EMSA探針的檢測試劑盒。同時本試劑盒也提供了EMSA檢測所需的結(jié)合緩沖液和上樣緩沖液，及一些關(guān)鍵的相關(guān)試劑，可以實現(xiàn)非同位素的EMSA檢測。
本試劑盒采用了高質(zhì)量的Streptavidin-HRP Conjugate，HRP和Streptavidin共價交聯(lián)的比例大于3，這樣比采用
Streptavidin和Biotin-HRP conjugate兩種試劑進(jìn)行檢測要更方便，并且靈敏度更高。
本試劑盒采用了非特異性結(jié)合比avidin更低的strepatavidin，使檢測結(jié)果背景更低靈敏度更高。
本試劑盒和信裕生物的各種生物素標(biāo)記EMSA探針可以配套使用。
本試劑盒沒有提供生物素探針標(biāo)記相關(guān)的試劑，其它特定的生物素標(biāo)記EMSA探針的制備可以使用信裕生物的EMSA探針生物素標(biāo)記試劑盒(GS008)。
EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X)中含有poly(dI-dC)等有效成分。其中poly(dI-dC)的濃度經(jīng)過優(yōu)化，可以很好的消除蛋白和標(biāo)記探針間的非特異性結(jié)合，同時又不會減弱目的轉(zhuǎn)錄因子和標(biāo)記探針間的結(jié)合。
本試劑盒可以用于100個蛋白和探針的結(jié)合反應(yīng)，并足夠檢測至少10塊有生物素標(biāo)記EMSA探針的膜。
包裝清單：

保存條件：
GS009-1至GS009-3和GS009-6在-20℃保存，其余可4℃保存。如果長期不用，整個試劑盒可-20℃保存，-20℃可以保存更長時間。
注意事項：
需自備帶正電荷尼龍膜，以及凝膠電泳時所需的相關(guān)試劑。帶正電荷尼龍膜(FFN10/FFN11/FFN13/FFN15)可以向信裕生物訂購。
如果需要使用更多的封閉液或洗滌液，可另外單獨訂購GS009B封閉液或GS009W洗滌液(5X)。
BeyoECL Moon A液和B液均對人體有害，操作時請小心，并注意有效防護(hù)以避免直接接觸人體或吸入體內(nèi)。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用說明：
1. 探針的標(biāo)記：
可以直接選購信裕生物的生物素標(biāo)記EMSA探針，或使用信裕生物生 產(chǎn)的EMSA探針生物素標(biāo)記試劑盒 (GS008)或其它合適的試劑盒進(jìn)行EMSA探針的生物素標(biāo)記。
2. 探針的純化和檢測：
信裕生物的各種生物素標(biāo)記EMSA探針都已經(jīng)過純化，可以直接使用；對于使用信裕生物的EMSA探針生物素標(biāo)記試劑盒(GS008)等試劑盒標(biāo)記的EMSA探針，通常 為實驗簡便起見，可以不必純化標(biāo)記好的探針。有些時候，純化后的探針會改善EMSA的電泳結(jié)果。詳細(xì)的探針純化和探針的標(biāo)記效率的檢測請參考EMSA探針生物素標(biāo)記試劑盒的相關(guān)說明。
3. EMSA膠的配制：
a.準(zhǔn)備好倒膠的模具?？梢允褂贸Ｒ?guī)的制備蛋白電泳膠的模具(例如BioRad的常規(guī)用于蛋白電泳的制膠裝置)，或其它適當(dāng)?shù)哪＞?。選擇可以灌制較薄 膠的模具，以便于干膠等后續(xù)操作。為得到更好的結(jié)果，可以選擇可灌制較大EMSA膠的模具。制膠前必須把制膠模具沖洗干凈，需特別注意不能有SDS殘留。
b.按照如下配方配制20ml 4%的聚凝膠(注意：使用29:1等不同比例的Acr/Bis對結(jié)果影響不大)。

c.按照上述順序依次加入各種試劑，加入TEMED前先混勻，加入TEMED后立即混勻，并馬上加入到制膠的模具中。避免產(chǎn)生氣泡，并加上梳 齒。如果發(fā)現(xiàn)非常容易形成氣泡，可以把一塊制膠的玻璃板進(jìn)行硅烷化處理。
4. EMSA結(jié)合反應(yīng)：
a.如下設(shè)置EMSA結(jié)合反應(yīng)：

b.按照上述順序依次加入各種試劑，在加入標(biāo)記好的探針前先混勻，并且室溫(20-25℃)放置10分鐘，從而消除可能發(fā)生的探針和蛋白的 非特異性結(jié)合，或者讓冷探針優(yōu)先反應(yīng)。然后加入標(biāo)記好的探針，混勻，室溫(20-25℃)放置20分鐘。
c.加入1μl EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液(無色，10X)，混 勻后立即上樣。注意：有些時候溴 酚藍(lán)會影響蛋白和DNA的結(jié)合，建議盡量使用無色的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液。如果對于使用無色上樣緩沖液在上樣時感覺到無法上樣，可以在無色上樣緩沖液里面添加極少量的藍(lán)色的上樣緩沖液，至可以觀察到藍(lán)顏色即可。
5.電泳：
a.用0.5XTBE作為電泳液。按照10V/厘米的電壓預(yù)電泳10分鐘。預(yù)電泳的時候如果有空余的上樣孔，可以加入少量稀釋 好的1X的EMSA上樣緩沖液(藍(lán)色)，以觀察電壓是否正常進(jìn)行。
b.把混合了上樣緩沖液的樣品加入到上樣孔內(nèi)。在多余的某個上樣孔內(nèi)加入10μl稀釋好的1X的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液(藍(lán)色)，用于觀察電泳進(jìn)行的情況。
c.按照10V/厘米的電壓電泳。確保膠的溫度不超過30℃，如果溫度升高，需要適當(dāng)降低電壓。電泳至EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液中的藍(lán)色染料溴酚藍(lán)至膠的下緣1/4處，停止電泳。
6. 轉(zhuǎn)膜：
a.取一和EMSA膠大小相近或略大的尼龍膜，剪角做好標(biāo)記，用0.5XTBE浸泡至少10分鐘。尼龍膜自始至終僅能使用鑷子夾取，并且僅可夾取不可能接觸樣品的邊角處。
b.取兩片和尼龍膜大小相近或略大的濾紙，用0.5XTBE浸濕。
c.把浸泡過的尼龍膜放置在一片浸濕的濾紙上，注意避免尼龍膜和濾紙間產(chǎn)生氣泡。
d.非常小心地取出EMSA膠放置到尼龍膜上，注意確保膠和膜之間沒有氣泡。
e.再把另外一片浸濕的濾紙放置到EMSA膠上，注意確保濾紙和膠之間沒有氣泡。
f.采用Western時所使用的濕法電轉(zhuǎn)膜裝置或其它類似的電轉(zhuǎn)膜裝置，以0.5XTBE為轉(zhuǎn)膜液，把EMSA膠上的探針、蛋白以及探針和蛋白的復(fù)合物等轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。對于大小約為10x8x0.1cm的EMSA膠，用BioRad的常用的Western轉(zhuǎn)膜裝置，電轉(zhuǎn)時可以設(shè)置為380mA(約100V)轉(zhuǎn)膜30-60分鐘。如果膠較厚，則需適當(dāng)延長轉(zhuǎn)膜時間。轉(zhuǎn)膜時需保持轉(zhuǎn)膜液的溫度較低，通?？梢园央娹D(zhuǎn)槽置于4℃冷庫或置于冰浴或冰水浴中進(jìn)行電轉(zhuǎn)，這樣可以確保低溫。具體的電轉(zhuǎn)膜方法請參考電轉(zhuǎn)膜裝置的使用說明。
g.轉(zhuǎn)膜完畢后，小心取出尼龍膜，樣品面向上，放置在一干燥的濾紙上，輕輕吸掉下表面明顯的液體。立即進(jìn)入下一步的交聯(lián)步驟，不可使膜干掉。
7. 交聯(lián)：
a.用紫外交聯(lián)儀(UV-light cross-linker)選擇254nm紫外波長，120mJ/cm2，交聯(lián)45-60秒。如果沒有紫外交聯(lián)儀可以使用普通的手提式紫外燈(例如信裕生物的手提紫外檢測儀(EUV002))，距離膜5-10厘米左右照射3-10分鐘。也可以使用超凈工作臺內(nèi)的紫外燈，距離膜5-10厘米左右照射3-15分鐘。的交聯(lián)時間可以使用標(biāo)準(zhǔn)品自行摸索。
b.交聯(lián)完畢后，可以直接進(jìn)入下一步檢測；也可以用保鮮膜包裹后在室溫干燥處存放3-5天，然后再進(jìn)入下一步檢測。如果檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)交聯(lián)效果不佳，甚至連free probe的條帶都非常微弱，可以考慮在膜干燥后參考步驟A的條件再交聯(lián)一次，以進(jìn)一步改善交聯(lián)效果。 
8. 化學(xué)發(fā)光法檢測生物素標(biāo)記的探針：
a.37-50℃水浴溶解封閉液和洗滌液。注意： 封閉液和洗滌液必須完全溶解后方可使用，封閉液和洗滌液可以在室溫至50℃之間使用，但必須確保這兩種溶液中均無沉淀產(chǎn)生，在冬天需特別注意。
b.取一合適的容器加入15ml封閉液，再放入交聯(lián)過的含有樣品的尼龍膜。在側(cè)擺搖床或水平搖床上緩慢搖動15分鐘。
c.取7.5μl Streptavidin-HRP Conjugate加入到15ml封閉液中(1:2000稀釋)，混勻備用。
d.去除用于尼龍膜封閉的封閉液，加入上一步中配制的15ml含有Streptavidin-HRP Conjugate的封閉液。在側(cè)擺搖床或水平搖床上緩慢搖動15分鐘。
e.取25ml洗滌液(5X)，加入100ml重蒸水或Milli-Q級純水，混勻配制成125ml洗滌液。
f.將尼龍膜轉(zhuǎn)移至另一裝有15-20ml洗滌液的容器內(nèi)，漂洗1分鐘。
g.去除洗滌液，加入15-20ml洗滌液，在側(cè)擺搖床或水平搖床緩慢上洗滌5分鐘。
h.重復(fù)步驟G 三次(共洗滌四次)，每次洗滌時間都約為5分鐘。 
i.將尼龍膜轉(zhuǎn)移至另一裝有20-25ml檢測平衡液的容器內(nèi)，在側(cè)擺搖床或水平搖床上緩慢搖動5分鐘。
j.取5ml BeyoECL Moon A液和5ml BeyoECL Moon B液混勻，配制成BeyoECL Moon工作液。
注意：BeyoECL Moon工作液必須現(xiàn)配現(xiàn)用。說明：從本步驟起操作方法和注意事項同Western實驗的熒光檢測。
k.取出尼龍膜，用吸水紙吸去過多液體。立即將膜的樣品面向上，放置到處于水平桌面上的潔凈容器內(nèi)或保鮮膜上。
l.在尼龍膜的表面小心加上步驟J配制好的共10ml BeyoECL Moon工作液，使工作液完全覆蓋尼龍膜。室溫放置2-3分鐘。
m.取出尼龍膜，用吸水紙吸去過多液體。將尼龍膜放在兩片保鮮膜或其它適當(dāng)?shù)耐腹獗∧ぶ虚g，并固定于壓片暗盒(也稱片夾)內(nèi)。
n.用X光片壓片1-5分鐘?？梢韵葔浩?分鐘，立即顯影定影，然后根據(jù)結(jié)果再調(diào)整壓片時間；也可以直接分別壓片30秒、1、3、5分鐘或更長時間，然后一起顯影定影觀察結(jié)果。