Easy-Load™ Blood Direct PCR Master Mix (2X)

信裕生物生產(chǎn)的Easy-Load™ Blood Direct PCR Master Mix (2X)，即Easy-Load™血液樣品直接PCR預(yù)混液(2X)，是一種使用特別便捷的專門用于血液樣品2倍濃度的PCR預(yù)混液，并且PCR結(jié)束后可以直接上樣電泳無需添加上樣緩沖液。本產(chǎn)品含有耐血的HemoTaq™ DNA聚合酶，這是一種經(jīng)過基因工程改造的非常高效的適用于EDTA、肝素或檸檬酸鈉抗凝血樣品或干血斑樣品直接PCR檢測(cè)的耐熱DNA聚合酶。
對(duì)于全血樣品可以直接PCR檢測(cè)，無須提取DNA。本產(chǎn)品對(duì)人、小鼠等全血中血紅素等各種PCR抑制劑表現(xiàn)出超強(qiáng)的抗性，對(duì)于新鮮采集的、4℃保存或低溫凍存EDTA、肝素或檸檬酸鈉抗凝的人或小鼠血液樣品或者干血斑(如whatman903或FTA采血卡上的干血斑)，都無需進(jìn)行DNA提取純化，可以直接用于PCR擴(kuò)增目的DNA。
所需血樣少，耐血能力高。本產(chǎn)品用于20μl的PCR擴(kuò)增體系時(shí)，通常僅加入約1μl抗凝全血即可順利完成PCR檢測(cè)。用于檢測(cè)細(xì)菌、病毒等微生物感染時(shí)，為獲得最高的檢測(cè)靈敏度，20μl的PCR擴(kuò)增體系中加入的血液量可以達(dá)到4μl，即20%體積，有些類型的抗凝血(例如人肝素抗凝血)加入的全血體積可以達(dá)到10μl，即50%體積。
兼容EDTA、肝素或檸檬酸鈉三種常見抗凝血。血液樣品用于PCR檢測(cè)時(shí)，EDTA、肝素或檸檬酸鈉抗凝血都可以兼容的。如果希望取得的檢測(cè)效果，優(yōu)先推薦EDTA抗凝血。因?yàn)镋DTA可以螯合多種核酸酶發(fā)揮酶活性所必須的金屬離子，從而可以更好地抑制核酸的降解。
本產(chǎn)品提供了一對(duì)陽性對(duì)照引物，便于確認(rèn)PCR檢測(cè)效果。該對(duì)引物是一種人和小鼠的通用引物，可以擴(kuò)增人或小鼠基因組DNA中β-actin基因的300bp DNA片段。
本產(chǎn)品的耐血體積百分比可以達(dá)到20-50%。本產(chǎn)品用于肝素、檸檬酸鈉和EDTA抗凝血PCR檢測(cè)的效果參考圖1。圖中可見，本產(chǎn)品對(duì)肝素(heparin)、檸檬酸鈉和EDTA處理的人全血的耐受體積百分比可以達(dá)到50%、20%和30%。對(duì)于小鼠全血的PCR檢測(cè)，本產(chǎn)品可以耐受的體積百分比也不小于20%。綜上，本產(chǎn)品用于PCR檢測(cè)時(shí)，推薦的全血的使用量為PCR總體積的1-20%，先的推薦用量為5-10%。
圖1. 信裕生物生產(chǎn)的Easy-Load™ Blood Direct PCR Master Mix (2X)擴(kuò)增圖中所示不同抗凝劑采集的人抗凝全血中目的基因的電泳效果圖。使用Easy-Load™ Blood Direct PCR Master Mix (2X)及本產(chǎn)品提供的Control primer mix，在PCR體系中直接加入5-50%不同體積百分比的不同抗凝劑采集的人抗凝血，用于擴(kuò)增β-actin基因的300bp DNA片段后的電泳效果圖。M, DNA marker (D0110 DNA Ladder (0.2-12 kb, 12 bands))。
本產(chǎn)品中含有的HemoTaq™ DNA Polymerase (Blood-resistant)的保真性和Taq DNA聚合酶相近，因此本產(chǎn)品建議主要用于血液檢測(cè)目的。如果目的是為了克隆特定基因，推薦使用D7243S/M HemoTaq™ HF DNA Polymerase (Blood-resistant)或者D7287S/M Easy-Load™ Blood Direct PCR Master Mix (HF, 2X)。
本產(chǎn)品可以輕松擴(kuò)增長達(dá)5kb的目的片段。本產(chǎn)品擴(kuò)增不同長度目的基因的效果參考圖2。圖中可見，Easy-Load™ Blood Direct PCR Master Mix (2X)以檸檬酸鈉抗凝全血為模板可以直接PCR擴(kuò)增出長達(dá)5kb的DNA片段。
圖2. 信裕生物生產(chǎn)的Easy-Load™ Blood Direct PCR Master Mix (2X)直接以10%檸檬酸鈉抗凝全血為模板擴(kuò)增不同長度的目的基因的效果圖。M, DNA marker (D0110 DNA Ladder (0.2-12 kb, 12 bands)); 1, β-actin (300bp); 2, CCR5 (630bp); 3, CCR5 (1100bp); 4, CCR5 (2000bp); 5, IL-6 (2841bp); 6, IL-6 (4171bp); 7, IL-6 (4882bp)。
本產(chǎn)品擴(kuò)增獲得的PCR產(chǎn)物帶有3'-dA overhangs的粘性末端，可直接用于和T載體連接進(jìn)行TA克隆。
用途：抗凝血樣品基因組DNA中目的基因的直接擴(kuò)增、基因分型(如基因缺失等)、血液樣品中細(xì)菌、病毒等微生物感染的基因檢測(cè)，以及基因敲除或轉(zhuǎn)基因小鼠基因型分析。
失活或抑制：酚氯仿抽提可以使Easy-Load™ Blood Direct PCR Master Mix (2X)中含有的HemoTaq™ DNA Polymerase失活。
本產(chǎn)品如果用于50微升的PCR反應(yīng)體系，兩種包裝的本產(chǎn)品分別足夠用于40個(gè)和200個(gè)反應(yīng)；如果用于20微升的PCR反應(yīng)體系，兩種包裝的本產(chǎn)品分別足夠用于100個(gè)和500個(gè)反應(yīng)。
包裝清單：

保存條件：
-20℃保存。適當(dāng)避免反復(fù)凍融。
注意事項(xiàng)：
由于PCR反應(yīng)非常靈敏，在使用Easy-Load™ Blood Direct PCR Master Mix (2X)時(shí)請(qǐng)注意避免微量待擴(kuò)增DNA的污染，并盡量考慮設(shè)置不加模板的空白對(duì)照以確認(rèn)是否有待擴(kuò)增DNA的污染。
抗凝血的推薦用量為PCR體系總體積的5-10%左右，可以直接添加到PCR體系中，無需進(jìn)行任何額外處理。
PCR反應(yīng)結(jié)束之后，建議3000-5000g離心3-5min以沉淀血細(xì)胞碎片，便于吸取上清用于電泳分析等。注意：由于抗凝血本身的原因，PCR結(jié)束后在PCR管底部會(huì)出現(xiàn)透明凝膠狀物質(zhì)，此為正常現(xiàn)象。
需自備Nuclease-Free Water。推薦選購信裕生物生產(chǎn)的ST876 BeyoPure™ Ultrapure Water (DNase/RNase-Free, Sterile)。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

使用說明：
1.PCR反應(yīng)體系的設(shè)置：
a.融解并混勻Easy-Load™ Blood Direct PCR Master Mix (2X)和Control primer mix (10μM each)，置于冰浴上或冰盒內(nèi)。
b.參考下表在冰浴上設(shè)置PCR反應(yīng)體系：

注意：
(a)模板使用量：作為PCR模板的抗凝血用量一般為PCR反應(yīng)體系總體積的1-20%，建議起始使用量為5%。如果PCR反應(yīng)用于檢測(cè)基因組的DNA片段，可以適當(dāng)減少抗凝血用量；如果用于檢測(cè)血液樣品中某種病毒或細(xì)菌等微生物的目的DNA片段，建議使用50μl的PCR體系，并使用較大的模板血量。對(duì)于高GC含量的PCR擴(kuò)增，可以嘗試向PCR體系中加入終濃度1-10% (體積百分比)的DMSO。對(duì)于干血斑樣品，20μl和50μl的PCR體系中分別推薦使用約0.8平方毫米和2平方毫米的干血斑。
(b)引物濃度：通常引物的終濃度為0.5μM時(shí)可獲得良好的檢測(cè)效果，也可以根據(jù)情況在0.1-1.0μM范圍內(nèi)調(diào)整引物的終濃度。擴(kuò)增效率不高的情況下，可提高引物的濃度；發(fā)生非特異性反應(yīng)時(shí)，可降低引物濃度。
c.用移液器輕輕吹打混勻或輕微Vortex混勻，室溫離心數(shù)秒，使液體積聚于管底。
d.如果所使用的PCR儀有熱蓋則省略本步驟。如果PCR儀沒有熱蓋，則在管內(nèi)滴入一滴礦物油(ST275 Mineral oil (礦物油))。
e.把設(shè)置好的PCR反應(yīng)體系置于PCR儀上，開始PCR反應(yīng)。
2.PCR反應(yīng)參數(shù)的設(shè)置可以參考如下表格：

注意：
a.起始變性(94℃，5min)可以使白細(xì)胞裂解，釋放出可用于PCR擴(kuò)增的基因組DNA。
b.需根據(jù)每次反應(yīng)的模板、引物、PCR產(chǎn)物的長度和GC含量等適當(dāng)優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，包括溫度、時(shí)間和循環(huán)數(shù)等。
c.對(duì)于初次進(jìn)行的PCR，為盡量確?？梢詳U(kuò)增出預(yù)期的PCR產(chǎn)物，可以把循環(huán)數(shù)設(shè)置為35。

常見問題：
1.PCR產(chǎn)物非常少或沒有特異性條帶。
a.引物設(shè)計(jì)不佳是PCR過程中最常見的問題。請(qǐng)選擇適當(dāng)?shù)囊镌O(shè)計(jì)軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，注意引物的GC含量、二級(jí)結(jié)構(gòu)、二聚體、退火溫度、長度、特異性等方面的問題。在加入酶切位點(diǎn)等的引物中，一定要注意加入酶切位點(diǎn)等后整條引物的GC含量、二級(jí)結(jié)構(gòu)、二聚體、退火溫度、長度、特異性等方面的問題。在原有引物效果不佳的情況并且陽性對(duì)照引物可以正常工作的情況下，可以考慮更換引物。
b.待擴(kuò)增片段GC含量偏高。向PCR體系中加入適合擴(kuò)增高GC含量DNA片段的試劑，并相應(yīng)地根據(jù)其要求或說明調(diào)整PCR反應(yīng)參數(shù)的設(shè)置。
c.目的片段過長。盡管HemoTaq™ DNA Polymerase可以擴(kuò)增最長達(dá)5kb的DNA片段，但大多數(shù)時(shí)候更適合擴(kuò)增2-3kb以下的片段。對(duì)于過長的目的片段的擴(kuò)增，需要適當(dāng)優(yōu)化引物和PCR反應(yīng)參數(shù)。
d.引物的二級(jí)結(jié)構(gòu)、引物二聚體或引物偏短會(huì)導(dǎo)致退火效果不佳。此時(shí)可以采用Touch down等方法進(jìn)行退火，通常采用從65℃逐步緩慢降溫到55℃或50℃的方法，使退火更加充分。
e.退火溫度不佳，需要優(yōu)化。如果有溫度梯度PCR儀，則可以設(shè)置退火的溫度梯度，摸索退火的溫度。如果沒有溫度梯度PCR儀，則可以通過多次PCR反應(yīng)摸索的退火溫度。
f.延伸時(shí)間不足?？砂凑彰?kb片段延伸2分鐘進(jìn)行設(shè)置，對(duì)于較難擴(kuò)增的片段可以設(shè)置為每1kb片段延伸3-4分鐘。
g.在不同PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，避免有時(shí)PCR儀出現(xiàn)問題。
h.循環(huán)數(shù)不足，適當(dāng)延長PCR的循環(huán)數(shù)。通常循環(huán)數(shù)最高不必超過40，常用的循環(huán)數(shù)范圍為30-40。
i.模板用量偏少，可以在耐血體積范圍內(nèi)適當(dāng)加大樣品用量，或采用巢式PCR (nested PCR)或二次PCR。巢式PCR即為在原先設(shè)計(jì)的PCR引物內(nèi)側(cè)再設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物，然后對(duì)次PCR產(chǎn)物進(jìn)行稀釋后再進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增，這樣一方面可以起到擴(kuò)增作用，同時(shí)也可以從次PCR產(chǎn)物中擴(kuò)增出特異性條帶。二次PCR則為比較簡(jiǎn)單地用原有引物對(duì)次PCR產(chǎn)物進(jìn)行稀釋后再進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增，可以起到擴(kuò)增作用，但不能去除非特異性條帶。
j.對(duì)PCR引物進(jìn)行脫鹽甚至PAGE膠或HPLC純化。
k.當(dāng)產(chǎn)生較多非特異性條帶時(shí)，可以適當(dāng)提高退火溫度。
l.注意設(shè)置適當(dāng)?shù)年栃詫?duì)照和陰性對(duì)照通常會(huì)對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判斷有很大幫助。
2.雜帶較多或條帶彌散
a.退火溫度提高2-5℃。
b.減少抗凝全血的用量。
c.在室溫配制PCR體系容易產(chǎn)生非特異性條帶。推薦在冰浴上配制PCR反應(yīng)體系。
d.如果模板的GC含量過高，需要考慮加入適合擴(kuò)增高GC含量DNA片段的試劑。
e.適當(dāng)縮短延伸時(shí)間。