Easy-Load™ PCR Master Mix (Orange, 2X)

信裕生物 的Easy-Load™ PCR Master Mix(Orange, 2X)是一種使用特別便捷的含有橙色染料(電泳位置約50bp)的2倍濃度的PCR預(yù)混液，含有2X Taq DNA Polymerase、2X PCR Buffer、2X dNTP和2X Loading Buffer，只需加入模板DNA、引物和水即可進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并且擴(kuò)增完畢后可以直接上樣電泳。主要適用于cDNA或基因組DNA等的常規(guī)PCR擴(kuò)增，特別適合于定性或半定量的PCR擴(kuò)增，也可用于長(zhǎng)度小于2kb的DNA片段的擴(kuò)增和克隆。
Easy-Load™ PCR Master Mix(Orange, 2X)中已經(jīng)含有所有的通用組分，用戶只需自備引物、模板DNA和水即可進(jìn)行PCR擴(kuò)增。大大簡(jiǎn)化了PCR操作，使操作更加快捷，也減少了PCR操作過(guò)程中可能導(dǎo)致的污染，使PCR的重復(fù)性更好。
Easy-Load™ PCR Master Mix(Orange, 2X)可以擴(kuò)增出長(zhǎng)達(dá)8kb的片段，但通常更適合用于擴(kuò)增2kb以下的DNA片段。
本產(chǎn)品中加入了橙色的電泳示蹤染料，其在濃度為1%瓊脂糖膠中的遷移位置大約位于50bp處。PCR結(jié)束后可直接進(jìn)行電泳檢測(cè)，無(wú)需再添加上樣緩沖液。橙色示蹤染料不會(huì)影響對(duì)相應(yīng)DNA條帶的觀察和檢測(cè)。
本產(chǎn)品穩(wěn)定性高，經(jīng)測(cè)試，反復(fù)凍融15次后對(duì)PCR的擴(kuò)增效果無(wú)顯著影響。反復(fù)凍融15次前后，使用不同引物擴(kuò)增100-
1500bp間不同長(zhǎng)度目的片段的效果如圖1所示。

圖1. 本產(chǎn)品反復(fù)凍融15次前后擴(kuò)增不同長(zhǎng)度產(chǎn)物的效果圖。A. 反復(fù)凍融前本產(chǎn)品進(jìn)行PCR的擴(kuò)增結(jié)果。B.反復(fù)凍融15次后的本產(chǎn)品進(jìn)行PCR的擴(kuò)增結(jié)果。除本產(chǎn)品是否反復(fù)凍融15次外，A和B的反應(yīng)體系完全相同，電泳的上樣量也相同。

每毫升Easy-Load™ PCR Master Mix若用于50微升的PCR反應(yīng)體系，足夠用于40個(gè)反應(yīng)；若用于20微升的PCR反應(yīng)體系，足夠用于100個(gè)反應(yīng)。
包裝清單：

保存條件：
-20℃保存至少一年有效。適當(dāng)避免反復(fù)凍融。如需頻繁使用，可取適量存放于4℃，至少3天內(nèi)有效。
注意事項(xiàng)：
由于PCR反應(yīng)非常靈敏，可使目的基因擴(kuò)增超過(guò)1000萬(wàn)倍，在設(shè)置PCR反應(yīng)時(shí)請(qǐng)注意避免微量待擴(kuò)增DNA的污染，并盡量考慮設(shè)置不加模板的空白對(duì)照以確認(rèn)是否有待擴(kuò)增DNA的污染。
Taq DNA polymerase在PCR過(guò)程中每個(gè)循環(huán)的出錯(cuò)幾率約為2.2×10^-5，對(duì)于大于1kb的DNA片段的克隆推薦使用出錯(cuò)幾率更低的DNA聚合酶，例如Pfu DNA polymerase、BeyoTaq DNA polymerase等。對(duì)于普通的PCR或RT-PCR進(jìn)行定性或定量檢測(cè)，Taq DNA polymerase是選擇。
盡管本產(chǎn)品經(jīng)過(guò)15次反復(fù)凍融后仍具有和凍融前幾乎相同的PCR擴(kuò)增效果，但仍宜適當(dāng)避免反復(fù)凍融本產(chǎn)品，多次反復(fù)凍融可能使產(chǎn)品性能下降。
使用本產(chǎn)品前，一定要完全融化，并上下顛倒輕輕混勻后才能使用，并盡量避免產(chǎn)生氣泡。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

使用說(shuō)明：

1. 1.PCR反應(yīng)體系的設(shè)置：
   1. a.室溫融解Easy-Load™ PCR Master Mix (Orange, 2X)，上下顛倒輕輕混勻后低速離心數(shù)秒。
   2. b.參考下表在冰浴上設(shè)置PCR反應(yīng)體系：
      ▼

      ▲

      試劑

      最終濃度

      體積

      體積

      雙蒸水或Milli-Q水

      -

      (21-x)μl

      (8.4-y)μl

      模板DNA

      10pg-1μg

      xμl

      yμl

      引物混合物(10μM)

      0.8μM

      4μl

      1.6μl

      Easy-Load™ PCR Master Mix (Orange, 2X)

      1X

      25μl

      10μl

      總體積

      -

      50μl

      20μl
      • 注意：(a)通常引物的終濃度為0.2μM時(shí)可獲得良好的檢測(cè)效果，也可以根據(jù)情況在0.1-1.0μM范圍內(nèi)調(diào)整引物的終濃度。擴(kuò)增效率不高的情況下，可提高引物的濃度；發(fā)生非特異性反應(yīng)時(shí)，可降低引物濃度。
      • (b) 對(duì)于不同類(lèi)型的模板在50μl反應(yīng)體積中推薦用量如下：
      • 哺乳動(dòng)物基因組DNA：0.1-1μg；大腸桿菌基因組DNA：10-100ng；質(zhì)粒DNA：0.1-10ng。過(guò)多的模板DNA容易導(dǎo)致非特異性的PCR產(chǎn)物。
   3. c.用移液器輕輕吹打混勻或輕微Vortex混勻，室溫離心數(shù)秒，使液體積聚于管底。
   4. d.如果所使用的PCR儀有熱蓋則省略本步驟。如果PCR儀沒(méi)有熱蓋，則在管內(nèi)滴入一滴礦物油(mineral oil，ST275)。
   5. e.各設(shè)置好的PCR反應(yīng)管置于PCR儀上，開(kāi)始PCR反應(yīng)。
2. 2.PCR反應(yīng)參數(shù)的設(shè)置可以參考如下示例：
   • STEP1(起始變性): 94℃ 3min
   • STEP2(變性): 94℃ 30sec
   • STEP3(退火): 55℃ 30sec
   • STEP4(延伸): 72℃ 1min
   • STEP5(循環(huán)): Go To STEP2 for 30 cycles
   • STEP6(最終延伸): 72℃ 10min
   • STEP7(臨時(shí)保存): 4℃ forever
3. 注意：
   1. a.PCR反應(yīng)的設(shè)置需根據(jù)模板、引物、PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度和GC含量等條件的不同設(shè)定不同的PCR反應(yīng)條件包括溫度、時(shí)間和循環(huán)數(shù)等。
   2. b.STEP4(延伸)的時(shí)間設(shè)置需根據(jù)PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度進(jìn)行設(shè)置，通常每kb產(chǎn)物的延伸時(shí)間為1分鐘。例如PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度為1kb，則延伸時(shí)間可以設(shè)置為1分鐘，PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度為2kb，則延伸時(shí)間可以設(shè)置為3分鐘，以此類(lèi)推。
   3. c.對(duì)于初次進(jìn)行的PCR，為盡量確?？梢詳U(kuò)增出預(yù)期的PCR產(chǎn)物，可以把循環(huán)數(shù)設(shè)置為35。對(duì)于需進(jìn)行半定量或定量的PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)一定要進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化，使PCR反應(yīng)沒(méi)有達(dá)到平臺(tái)期。
4. 3.結(jié)果檢測(cè)PCR結(jié)束后直接取5-10μl進(jìn)行電泳檢測(cè)，無(wú)需添加上樣緩沖液。

常見(jiàn)問(wèn)題：

1. 1.PCR產(chǎn)物非常少或沒(méi)有特異性條帶。
   1. a.引物設(shè)計(jì)不佳是PCR過(guò)程中最常見(jiàn)的問(wèn)題。請(qǐng)選擇適當(dāng)?shù)囊镌O(shè)計(jì)軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，注意引物的GC含量、二級(jí)結(jié)構(gòu)、二聚體、退火溫度、長(zhǎng)度、特異性等方面的問(wèn)題。在加入酶切位點(diǎn)等的引物中，一定要注意加入酶切位點(diǎn)等后整條引物的GC含量、二級(jí)結(jié)構(gòu)、二聚體、退火溫度、長(zhǎng)度、特異性等方面的問(wèn)題。在原有引物效果不佳的情況并且陽(yáng)性對(duì)照引物可以正常工作的情況下，可以考慮更換引物。
   2. b.待擴(kuò)增片斷GC含量偏高。GC含量較高的情況下PCR會(huì)變得相對(duì)比較困難，此時(shí)可以使用適合擴(kuò)增高GC含量DNA片斷的GC-rich buffer，并相應(yīng)地根據(jù)GC-rich buffer的要求或說(shuō)明調(diào)整PCR反應(yīng)參數(shù)的設(shè)置。
   3. c.長(zhǎng)片段擴(kuò)增。盡管Taq DNA polymerase可以擴(kuò)增最長(zhǎng)達(dá)8kb的DNA片段，但大多數(shù)時(shí)候比較適合擴(kuò)增2-3kb以下的片段，更長(zhǎng)片段的擴(kuò)增推薦使用其它更適合長(zhǎng)片段擴(kuò)增的DNA聚合酶。
   4. d.PCR反應(yīng)設(shè)置時(shí)在室溫進(jìn)行容易導(dǎo)致非特異性條件。推薦在冰浴上設(shè)置PCR反應(yīng)。
   5. e.由于引物存在一定的二級(jí)結(jié)構(gòu)或存在一定的引物二聚體，或引物偏短，導(dǎo)致退火效果不佳。此時(shí)可以采用Touch down等方法進(jìn)行退火，通常采用從65℃逐步緩慢降溫到55℃或50℃的方法，使退火更加充分。
   6. f.退火溫度不佳，需要優(yōu)化。如果有溫度梯度PCR儀，則可以設(shè)置退火的溫度梯度，摸索退火的溫度。如果沒(méi)有溫度梯度PCR儀，則可以通過(guò)多次PCR反應(yīng)摸索的退火溫度。
   7. g.延伸時(shí)間不足?？砂凑彰?kb片段延伸1分鐘進(jìn)行設(shè)置，對(duì)于較難擴(kuò)增的片段可以設(shè)置為每1kb片段延伸1.5-2分鐘。
   8. h.待擴(kuò)增片段GC含量較高或長(zhǎng)度較長(zhǎng)，變性不夠充分?？梢哉{(diào)節(jié)起始變性條件至95℃ 1min甚至95℃ 2-4min。
   9. i.在不同PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，避免有時(shí)PCR儀出現(xiàn)問(wèn)題。
   10. j.循環(huán)數(shù)不足，適當(dāng)延長(zhǎng)PCR的循環(huán)數(shù)。通常循環(huán)數(shù)最高不必超過(guò)40，常用的循環(huán)數(shù)范圍為25-35。
   11. k.模板含量太低，適當(dāng)加大模板量，或采用巢式PCR(nested PCR)或二次PCR。巢式PCR即為在原先設(shè)計(jì)的PCR引物內(nèi)側(cè)再設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物，然后對(duì)次PCR產(chǎn)物進(jìn)行稀釋后再進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增，這樣一方面可以起到擴(kuò)增作用，同時(shí)也可以從次PCR產(chǎn)物中擴(kuò)增出特異性條帶。二次PCR則為比較簡(jiǎn)單地用原有引物對(duì)次PCR產(chǎn)物進(jìn)行稀釋后再進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增，可以起到擴(kuò)增作用，但不能去除非特異性條帶。
   12. l.模板中含有抑制PCR反應(yīng)的物質(zhì)，可以用適當(dāng)?shù)腄NA純化方法例如柱純化等純化模板DNA。
   13. m.當(dāng)產(chǎn)生較多非特異性條帶時(shí)，可以適當(dāng)提高退火溫度。
   14. n.注意設(shè)置適當(dāng)?shù)年?yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照通常會(huì)有很大幫助。