BeyoRT™ III M-MLV反轉錄酶

信裕生物生產的BeyoRT™ III M-MLV反轉錄酶，即BeyoRT™ III M-MLV reverse transcriptase，是一種經過改造和優(yōu)化的快速高效(短至10min完成反轉錄)、熱穩(wěn)定(高達55℃)、高精確度、產物超長(長達12kb)的反轉錄酶，具有正常的依賴于RNA或DNA模板的DNA聚合酶活性，能夠以RNA或DNA為模板，在引物存在的情況下進行互補DNA鏈的合成，即可以進行cDNA(complementary DNA)的鏈合成。同時本反轉錄酶保留了RNase H活性，能選擇性剪切RNA和DNA雜合雙鏈中的RNA，有利于后續(xù)cDNA第二鏈的合成。
本產品是最常用的優(yōu)質反轉錄酶之一，廣泛用于獲得總RNA或mRNA后cDNA條鏈的合成，后續(xù)可以用于PCR、real-time PCR也稱定量PCR(quantitative PCR, qPCR)、cDNA的第二鏈合成以及cDNA文庫的構建，尤其是逆轉錄所得目的基因的克隆等。BeyoRT™ III M-MLV反轉錄酶還可以通過反轉錄用于DNA探針的熒光、生物素、或同位素標記等，也可以通過引物延伸(primer extension)來分析和研究RNA。
M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus)，也稱MMLV或M-MuLV；反轉錄酶(reverse transcriptase)也稱逆轉錄酶或RT酶。
本產品反轉錄快速高效，普通反轉錄僅需10min。實測小于3kb的片段，42℃反轉錄10min即可完成，與反轉錄60min相比無顯著差別。大于3kb的片段，特別是大于6kb的片段，推薦反轉錄60min，以獲得的反轉錄效果。
本產品反轉錄產物長度超長。本產品經測試可以輕松完成長度為8 kb以下基因的反轉錄(參考圖1)，反轉錄的長度可以達到12 kb。

圖1. 使用BeyoRT™ III M-MLV反轉錄酶反轉錄總RNA后，對于不同長度的cDNA進行PCR擴增后的電泳效果圖。圖中可見0.2-12kb的cDNA可以非常高效地被反轉錄。

本產品熱穩(wěn)定性好，反轉錄效率高。本產品最適反應溫度為42℃，當溫度達到50℃時仍具有很高活性，對于長度較短的cDNA反轉錄，溫度達到55℃時也可獲得較高產量的cDNA。高溫反轉錄對于高GC含量RNA的反轉錄，能有效減少二級結構，提升反轉錄效率。本產品反轉錄速度快，6kb以下的cDNA反轉錄只需0.5h即可完成，3kb以下的cDNA反轉錄10min即可完成(參考圖2)。

圖2. BeyoRT™ III M-MLV反轉錄酶在不同溫度反應不同時間的反轉錄效果。從HEK293T細胞抽提獲得的總RNA 2µg，在20μl反轉錄體系中按照圖中所示溫度、時間進行反轉錄。反轉錄后取1μl反轉錄產物進行目的基因(2.6kb的YWHAZ基因和6.0kb的ADAR1基因)的PCR擴增和電泳。

本產品性價比高。BeyoRT™ III M-MLV反轉錄酶是一種大腸桿菌重組高表達的反轉錄酶，由于其表達量非常高，大大提高了本產品的性價比。本反轉錄酶為表達含有從Moloney Murine Leukemia Virus reverse transcriptase基因克隆的pol基因，并進行了多個突變優(yōu)化以提高其熱穩(wěn)定性、反轉錄效率、反轉錄長度和表達量。
酶活性定義：One unit of the enzyme incorporates 1 nmol of dTTP into acid-precipitable material in 10 min at 37℃ using poly(A)•oligo(dT)_12-18 as template-primer。反應體系為 50 mM Tris-HCl(pH 8.3), 75 mM KCl, 3 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 0.5mM [³H]-dTTP and 0.4 mM polyA•oligo(dT)_12-18。
純度：不含DNA內切酶、外切酶和磷酸酯酶和RNA酶，可以滿足常規(guī)反轉錄合成cDNA條鏈等的需要。
酶儲存溶液：20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.01%(v/v) 
NP-40 and 50%(v/v) glycerol。
失活或抑制：80℃孵育10分鐘可以導致BeyoRT™ III M-MLV反轉錄酶失活；EDTA、EGTA等螯合劑、無機磷酸鹽或焦磷酸鹽以及聚氨(polyamine)對BeyoRT™ III M-MLV反轉錄酶有抑制作用。
本產品中M-MLV反轉錄酶的濃度為200U/µl，用于體積為20μl的反轉錄體系時，本試劑盒的不同包裝足夠分別進行50次、250次和1000次反轉錄反應。
包裝清單：

保存條件：
-20℃保存。
注意事項： 
對于GC含量比較高的RNA的反轉錄，產品的使用說明中給予了特別說明，請予以關注。
本產品僅限于專業(yè)人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
 

使用說明：
1. cDNA條鏈的合成(First-stand cDNA Synthesis)：
a. 參考如下表格中設置的20μl反轉錄體系(RNase Inhibitor (R0102)和dNTP mix (D7373)可從信裕生物訂購)：

*To 13.7μl表示加入DEPC-treated Water至最終體積為13.7μl。
**dNTP濃度不同時使用的體積需作適當調整，此時DEPC-treated Water的用量需適當調整。
b. 輕輕混勻(用移液器輕輕吹打混勻或用渦旋混合器在最低速度輕輕混勻)，隨后離心沉淀液體。
c. 如果使用Oligo(dT)₁₈或基因特異性引物，42℃孵育10-60 min。如果使用random hexamer(隨機六聚體)作為引物，先在25℃孵育10 min，隨后在42℃孵育10-60 min。反轉錄3kb以下的cDNA，反轉錄10min即可，反轉錄3-6kb的cDNA，反轉錄30min即可，而6kb以上的cDNA推薦反轉錄60min。當使用random hexamer(隨機六聚體)作為引物，并且后續(xù)用于qPCR時，后續(xù)檢測任何長度的基因，均反轉錄10min就足夠了。注意：對于GC含量較高或二級結構比較嚴重的模板RNA，可以50℃孵育60min，以充分利用本產品在50℃時仍有良好的反轉錄酶活性這一特點，在較高溫度進行反轉錄可以有效減少二級結構的干擾。
d. 80℃孵育10 min以失活BeyoRT™ III M-MLV反轉錄酶并終止反轉錄反應。說明：對于5kb以上的長片斷cDNA不推薦采用加熱的方法失活反轉錄酶，該方法易導致部分長片斷DNA被剪切，此時可考慮酚氯仿抽提或柱純化方法。
e. 反轉錄產物可以直接用于后續(xù)的PCR反應等，也可以-20℃凍存以備以后使用。用于后續(xù)PCR反應時，如果PCR的反應體系為20μl和50μl，則推薦相應地使用0.8μl和2μl反轉錄產物。
2. 引物延伸、探針標記等其它用途請自行參考M-MLV反轉錄酶的相關文獻資料進行。

常見問題：
1. 總RNA反轉錄產物電泳觀察不到。
a. 反轉錄產物由于是從模板反轉錄而獲得，而模板的量本身比較低，反轉錄的量通常還要少于模板量，并且總RNA的反轉錄產物大小很不均勻，因此通?？俁NA的反轉錄產物直接電泳觀察是觀察不到的。 
2. 反轉錄產物通過PCR擴增沒有特異性條帶。
a. PCR擴增沒有獲得特異性條帶時建議先使用actin、GAPDH等作為內參進行PCR擴增，看是否可以成功擴增。如果可以成功，則說明PCR擴增體系沒有問題，此時通常是目的基因的引物設計欠佳，當然也有可能是反轉錄產物質量欠佳。如果內參不能被很好地擴增，則有可能PCR體系存在問題或反轉錄產物質量欠佳。
b. 模板RNA發(fā)生了降解。哺乳動物細胞或組織的總RNA瓊脂糖電泳后應該可以看到清晰的18S和28S rRNA條帶，并且28S rRNA和18S rRNA的亮度比例應該大于等于2.0。如果比例小于2.0，則提示總RNA發(fā)生了顯著的降解，能重新制備總RNA樣品。避免RNA降解的主要方法是，嚴格進行RNA的相關操作，包括帶潔凈手套、戴一次性口罩、在潔凈環(huán)境中抽提或制備RNA，以盡量避免RNase污染。
c. 模板RNA的純度偏低。在提取純化RNA的過程中，殘留在溶液中的一些成分如苯酚、SDS、EDTA、胍鹽、磷酸、焦磷酸、多胺、亞精胺等會抑制反轉錄酶活性。對RNA樣品進行柱純化，或者進行沉淀、洗滌和再溶解，通?？梢杂行コ龤埩舻奈廴疚铩Ｍǔ＿x擇使用信裕生物的BeyoZol或Trizol抽提獲得的總RNA完全可以滿足反轉錄反應的需要。
d. 反轉錄反應的模板量不足。在抽提獲得總RNA后，在進行一些精細的定量檢測時通常會進行DNase I消化，以充分去除可能的殘留的DNA的干擾。DNase I進行熱失活時，需要加入EDTA至終濃度為2.5mM，否則RNA在沒有螯合劑的情況下，在加熱過程中容易被水解，從而導致模板量不足。此外，擴增特定基因時，需要先查詢該基因的組織分布特點，利用其高表達的組織進行目的基因的反轉錄和克隆。用該基因豐度極低的組織或細胞樣品進行反轉錄和PCR擴增，通常會由于模板量過少而PCR擴增失敗。
e. 沒有使用適當的反轉錄引物。對于細菌RNA和不含poly(A)尾巴的RNA，要用random hexamer引物代替Oligo(dT)₁₈引物。使用基因特異性反轉錄引物時，需要確保基因特異性引物設計合理正確。
f. 如果RNA模板富含GC或容易形成二級結構，此時可以考慮把反轉錄溫度提高到45-55℃。