一站式His標(biāo)記蛋白質(zhì)微量純化套裝

產(chǎn)品及特點(diǎn)基于 His-Ni 親和層析的蛋白質(zhì)純化方法是目前分離純化重組表達(dá)蛋白質(zhì)的重要方法，本產(chǎn)品就是專門用于上述實(shí)驗(yàn)的一站式產(chǎn)品，具有下列特點(diǎn)：

1. 一站式套裝，含所需的介質(zhì)、溶液和層析柱，用戶只需要提供表達(dá) His 蛋白的細(xì)菌（酵母、桿狀病毒、培養(yǎng)細(xì)胞）即可，非常方便。

2. 專一性強(qiáng)，一次過柱即可獲得純度高達(dá) 95%的 His-標(biāo)記蛋白。

3. 變性和非變性條件均可使用，也適用于純化包涵體中的 His 標(biāo)記蛋白。

4. 每次可以處理 20 mL 的表達(dá)菌液，適合初步篩選和鑒定。

5. 提供 4 mL 濃度為 50%的 Ni-Agarose 介質(zhì)，其大載量為 20-30 mg His標(biāo)記蛋白質(zhì)/mL 介質(zhì)。

6. 介質(zhì)為 CL-6B 瓊脂糖，含四個(gè) Ni 離子螯合基團(tuán)，比只有四個(gè) Ni 離子螯合基團(tuán)的 Ni-IDA 更有效。

7. 本介質(zhì)可以反復(fù)使用多次。
規(guī)格及成分 成份 編 號(hào) 小扁盒包裝
Ni-Agarose 介質(zhì)，50% LM100102 4 mL
1 M 咪唑溶液 100102a 25 mL
1 M Tris-HCl 溶液，pH7.9 100102b 25 mL
5 M NaCl 溶液 25-06290 25 mL
溶菌酶（20KU/mg） 80103c 30 mg(黃蓋)
Benzonase 溶液（2U/uL） 100102c 20 uL(紅蓋)
鹽酸胍 50-01-1 6 g
尿素 57-13-6 20 g
PMSF 溶液（10mg/mL） 100833 0.5 mL(白蓋)
親和層析柱，6 mL 110809 1 套
使用手冊(cè) 1 份 1 份

運(yùn)輸及保存 常溫運(yùn)輸和保存，但介質(zhì)長期需 4℃保存，溶菌酶、Benzonase 溶液和 PMSF 溶液需-20℃保存，有效期一年

自備試劑 去離子水、20%乙醇、針頭過濾器（0.45 μm）

使用方法

1. 將 Ni-Agarose 介質(zhì)充分混勻后，取適量加入到預(yù)放了一片篩板的層析柱中

（介質(zhì)用量需要根據(jù) His 蛋白產(chǎn)量決定，其大載量為 20-30 mg His 標(biāo)記

蛋白質(zhì)/mL 介質(zhì)，請(qǐng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要取適量的 Ni-Agarose 介質(zhì)加入層析柱）。

2. 用 5 倍柱體積（指填料的體積，下同）自備去離子水洗柱，共三次。

3. 用 5 倍柱體積的新配結(jié)合液洗柱（配方如下，以 10 mL 為例），共三次：

成分 用量 在結(jié)合緩沖液中的濃度

1 M Tri-HCl（pH7.9） 0.2 mL 20 mM

1 M 咪唑溶液 0.1 mL 10 mM

5 M NaCl 溶液 1 mL 500 mM

自備去離子水 8.7 mL -

4. 室溫 5000 g 離心 10 分鐘收集 20 mL 表達(dá)菌液，棄上清，沉淀（約 100 mg）

放冰上待用或放-80℃保存。好用不加誘導(dǎo)物的菌液做對(duì)照樣。

5. 如果超聲破碎細(xì)菌：加入 1 mL 冰浴的結(jié)合液（1 mL 菌液需要用 50 uL 結(jié)

合液），再加入 25 uL PMSF（10 mg/mL）溶液，冰上超聲裂解菌體直到

在顯微鏡下看見絕大多數(shù)細(xì)胞破裂。超聲參數(shù)需根據(jù)儀器型號(hào)自行摸索，但

裂解物必須不粘稠，否則會(huì)堵塞層析柱。如果酶法裂解細(xì)菌：加入 1 mL 冰

浴的含溶菌酶的結(jié)合液（先取 20 mL 結(jié)合液，加入所有 30 mg 溶菌酶干粉，

溶解后分裝成 1 mL/管，剩余的-20℃放置），再加入 25 uL PMSF（10

mg/mL）溶液和 1 uL Benzonase，冰上放置 30 分鐘。

6. 4℃下 13000-15000 g 離心 10 分鐘，去除殘留細(xì)胞和細(xì)胞碎片以防堵柱，

收集上清，留樣做 SDS-PAGE 電泳對(duì)照。如果要純化裂解液中可溶部分的

His 標(biāo)記蛋白，則直接進(jìn)入第 7 步；如果要純化裂解液中包涵體（沉淀部分）

中的 His 標(biāo)記蛋白，則直接進(jìn)入第 12 步。

A、純化細(xì)胞裂解液中可溶部分的 His 標(biāo)記蛋白

7. 將上步得到的上清液上柱，讓重力使裂解液自然流出。如要提高 His 標(biāo)記蛋

白與介質(zhì)的結(jié)合效率，可用試劑盒提供的紅蓋將層析柱下的漏液口堵上，讓

細(xì)菌裂解液和介質(zhì)在 4℃結(jié)合 30 分鐘或過夜。

8. 用 10 倍柱體積結(jié)合液洗柱（配方見上表），收集并保存穿透液（含雜質(zhì)或沒

被吸附的 His 標(biāo)記蛋白，可做 SDS-PAGE 電泳的對(duì)照）。

9. 如果用一步式洗脫法（適合已經(jīng)找到佳咪唑濃度的情況），則直接用適量

的新鮮配制的洗脫液洗柱，收集并保存穿透液（含 His 標(biāo)記蛋白）。洗脫液

的配方如下（以 1 mL 體積和佳咪唑濃度是 500 mM 為例）：

成分 用量 在洗脫液中的濃度

1 M Tri-HCl （pH7.9） 20 uL 20 mM

1 M 咪唑溶液 500 uL 500 mM

5 M NaCl 溶液 100 uL 500 mM

自備去離子水 380 uL -

10.如果用多步式洗脫（適合不知道佳咪唑濃度或一步式洗脫雜質(zhì)多的情況），

則按上表配制一系列咪唑濃度不同（如 40、60、100、200、300 和 500

mM），其他成分濃度不變的洗液，按從低到高的順序洗滌并收集樣品，

SDS-PAGE 電泳檢測 His 標(biāo)記蛋白所在的區(qū)域。

11.洗脫后，依次使用10 倍柱體積的去離子水洗滌柱子，再用 3倍柱體積的20%

乙醇平衡（乙醇要將填料浸沒），后堵住層析柱下端的漏口，4℃保存待下

次使用。

B、純化包涵體中 His 標(biāo)記蛋白

12.將第 6 步離心得到的包涵體沉淀重懸于 1-3 mL 含鹽酸胍結(jié)合液中或 1-3

mL 含尿素結(jié)合液中（建議優(yōu)先使用尿素做變性劑，因?yàn)榈玫降南疵撘嚎梢?/p>

直接跑 SDS-PAGE，而用鹽酸胍的洗脫液需先除鹽后才能電泳）。冰浴 1 小

時(shí)以使包涵體溶解，期間可輕柔搖晃幾次。含變性劑的結(jié)合液配方如下（以

10 mL 為例）：

成分 含鹽酸胍結(jié)合液 含尿素結(jié)合液

1M Tri-HCl（pH 7.9） 200 uL 200 uL

5M NaCl 溶液 1 mL 1 mL

鹽酸胍（MW=95.6） 5.7 g 無

尿素（MW=60.1） 無 4.8 g

自備去離子水 加水到 10 mL 加水到 10 mL

13.室溫 10000×g 離心 20 分鐘，沉淀為未溶解的包涵體。將上清（含溶解后

的 His 標(biāo)記蛋白）以自備的針頭過濾器（0.45 μm）過濾。

14.將濾過液上柱，后續(xù)純化步驟同第 7-第 11 步。只是所用結(jié)合液和洗脫液均

含變性劑，含變性劑的洗脫液配方見下表（以 1 mL 為例）：

成分 含鹽酸胍洗脫液 含尿素洗脫液

1M Tri-HCl（pH7.9） 20 uL 20 uL

1M 咪唑溶液 500 uL 500 uL

5M NaCl 溶液 100 uL 100 uL

鹽酸胍（MW=95.6） 0.57 g 無

尿素（MW=60.1） 無 0.48 g

自備去離子水 補(bǔ)水到 1 mL 補(bǔ)水到 1 mL