釀酒酵母AH109化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞

產(chǎn)品及特點(diǎn) AH109 菌株來(lái)源于 PJ69-2A 酵母菌株，將 lacZ 報(bào)告基因引入 PJ69-2A 誕生了 AH109，此菌株是 Clontech 公司開發(fā)的 GAL4 系統(tǒng)酵母雙雜實(shí)驗(yàn)用菌株，MATa 型，可 直接轉(zhuǎn)化質(zhì)粒或與 MATα型酵母菌株 Y187 通過(guò) mating 操作進(jìn)行蛋白互作驗(yàn)證或篩庫(kù)試 驗(yàn)。Transformation marker 為: trp1, leu2，報(bào)告基因?yàn)椋簂acZ, HIS3, ADE2, MEL1。 AH109-GAL4酵母雙雜系統(tǒng)需要兩種質(zhì)粒配套使用：PGBKT7和PGADT7。質(zhì)粒PGBKT7 的篩選標(biāo)志為 TRP1，用于表達(dá) DNA-BD(來(lái)自酵母轉(zhuǎn)錄因子 GAL4N 端 1~ 174 位氨基酸) 與目標(biāo)蛋白(Bait)的融合蛋白；質(zhì)粒 PGADT7 的篩選標(biāo)志為 LEU，用于表達(dá) AD(GAL4 C 端 768 ~881 位氨基酸)與目標(biāo)蛋白（Prey）的融合蛋白。

GAL4 系統(tǒng)原理：一個(gè)完整的酵母轉(zhuǎn)錄因子 GAL4 可分為功能上相互獨(dú)立的兩個(gè)結(jié)構(gòu) 域：位于 N 端 1 ~ 174 位氨基酸區(qū)段的 DNA 結(jié)合域（DNA-BD）和位于 C 端 768 ~881 位氨基酸區(qū)段的轉(zhuǎn)錄激活域(AD)。DNA-BD 能夠識(shí)別 GAL4-responsive gene 的上游激活 序列 UAS，并與之結(jié)合。而 AD 可以啟動(dòng) UAS 下游的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。BD 和 AD 單獨(dú)存在 不能激活轉(zhuǎn)錄，但當(dāng)二者接近時(shí)，則呈現(xiàn)完整的 GAL4 活性，使含有 UAS 的啟動(dòng)子下游基 因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。正常條件下，BD 不與 AD 結(jié)合，將要檢測(cè)的蛋白質(zhì)分別與 BD 和 AD 融合， 形成 bait 融合蛋白（bait -BD）和 prey 融合蛋白（prey-AD），如果 bait 和 prey 發(fā) 生相互作用，就會(huì)促使 BD 和 AD 的相互接近，形成完整的 GAL4，從而激活報(bào)告基因 的轉(zhuǎn)錄。AH109 有四個(gè)報(bào)告基因：lacZ, HIS3, ADE2, MEL1，分別由三種不同的啟動(dòng)子 （GAL1，GAL2，MEL1）啟動(dòng)，這三種啟動(dòng)子只有 GAL4 識(shí)別的 17bp 核心區(qū)相同，其 余部分均不同，大大降低了酵母雙雜假陽(yáng)性發(fā)生的概率。

本產(chǎn)品經(jīng)特殊工藝制作而成，經(jīng)PGADT7質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率為＞104 cfu/μg DNA。

菌株基因型如下：MATa, trp1-901, leu2-3, 112, ura3-52, his3-200, gal4Δ, gal80Δ,LYS2::GAL1UAS-GAL1TATA-HIS3, MEL1 GAL2UAS-GAL2TATA-ADE2, URA3::MEL1UAS-MEL1TATA-lacZ
規(guī)格及成分 成分 編號(hào) 包裝
AH109 感受態(tài)細(xì)胞 LM140386a 0.1 mL×10
PGADT7，10 ng/μL LM140386b 10 μL
Carrier DNA，5 μg/μL LM140386c 100 μL
PEG/LiAc LM140386d 5 mL
使用手冊(cè) LM140386sc 1 份

運(yùn)輸及保存 感受態(tài)細(xì)胞干冰運(yùn)輸、-80℃保存，Carrier DNA -20℃保存；PEG/LiAc 4℃保存；有效 期半年。

自備試劑 目的 DNA、YPDA、 SD 培養(yǎng)基等

使用方法

1. 取感受態(tài)細(xì)胞置于冰浴中。一次轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的建議用量為 50-100 μL，可以根據(jù) 實(shí)際情況分裝使用。 以下實(shí)驗(yàn)以 100 μL 感受態(tài)細(xì)胞為例。

2. 待感受態(tài)細(xì)胞融化后，向感受態(tài)細(xì)胞懸液中依次加入 2-5 μg 預(yù)冷的目的質(zhì)粒、10μL Carrier DNA（95-100℃ 5 分鐘，快速冰浴，重復(fù)一次）、500 μL PEG/LiAc， 吹打混勻，30℃水浴 30 分鐘（15 分鐘時(shí)翻轉(zhuǎn) 6-8 次混勻）。

3. 42℃水浴 15 分鐘（7.5 分鐘時(shí)翻轉(zhuǎn) 6-8 次混勻）。

4. 5000 rpm 離心 40 秒，棄上清。取 400 μL ddH2O 重懸沉淀，5000 rpm 離心 30 秒，棄上清。

5. 取 50 μL ddH2O 重懸沉淀，涂板，29℃培養(yǎng) 48-96 小時(shí)。