T3體外轉錄試劑盒

產(chǎn)品及特點 本試劑盒是基于沙門氏噬菌體 T3 RNA 聚合酶的 RNA 體外轉錄試劑盒，它利用含有 T3 啟動子的模版 DNA，以 NTP 為底物，從 T3 啟動子下游開始合成與模板 DNA 中一條鏈互補的 RNA，簡單快速獲得大量的 RNA 分子。本產(chǎn)品具有下列特點：

1. 即開即用，用戶只需提供含 T3 啟動子的 DNA 模板即可以進行體外轉錄實

驗，不需單獨準備每一個成份。

2. 單溶液預配液，減少加樣次數(shù)，避免了操作誤差，增加了可重復性。

3. 模板 DNA 可以是線性化的質(zhì)粒 DNA，也可以是 PCR 擴增產(chǎn)物。

4. 可以合成的 RNA 的佳長度在 20 nt 到 5000 nt 之問。

5. 產(chǎn)品配方經(jīng)過精心優(yōu)化，每μg DNA 模板可以合成 2-6 μg RNA。

6. 得到的 RNA 可以用于 RNA 結構研究、核解生物化學、體外翻譯、RNA蛋白質(zhì)相互作用、反義技術、SELEX技術和 RNA 干擾（RNAi）等實驗。
規(guī)格及成分 成份 編號 十孔盒包裝
2×T3 轉錄預配液 LM91108a 0.5 mL（本色蓋）
T3 RNA 聚合酶混合液 LM120309 50 μL（紅色蓋）
RNase-free 水 LM80403 1 mL（亮黃蓋）
使用手冊 LM91108sc 1 份

運輸及保存 低溫運輸，-20℃保存, 有效期一年。

自備試劑 如果需要去除轉錄產(chǎn)物中的 DNA 模板，則需要 RNase-free DNase 、Tris 飽和酚、氯仿、微量核酸沉淀劑、RNase-free 75%乙醇（均可從本公司另購）

使用方法 一、制備 DNA 模板

PCR 片段和質(zhì)粒 DNA 都可以用作體外轉錄的模板，但是必須注意以下幾點。一是必須使用線性化的 DNA。如果是質(zhì)粒 DNA，則必須先用適當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶切成線狀。二是需要轉錄的 DNA 序列的上游必須有 T3 啟動子。如果模板是 PCR 產(chǎn)物，則可以在設計引物時將 T3 啟動子序列（5’AATTAACCCTCACTAAAGG 3’）加上。如果是將 DNA 片段克隆到載體上，則需要選擇有 T3 啟動子的載體，并且克隆位點必須位于 T3 啟動子下游。三是需要轉錄的 DNA 序列的下游端好不要是 3’突出。如果是 3’突出（如選擇了 Pst I 來線性化質(zhì)粒），則好用 T4 DNA 聚合酶修平。四是必須保證 DNA一般要使用大量的 RNase A，因此質(zhì)粒 DNA 一般都有嚴重的 RNase A 污染，所以在用作模板前，好采取膠回收得方法回收質(zhì)粒 DNA。并且加入少量總 RNA 一起保溫，然后電泳檢測 RNA 是否被降解，以此判斷純化的DNA 模板是否有殘留 RNase A。

二、體外轉錄反應

1. 如果有 N 個樣品，強烈建議做一個陰性對照，故共設置 N+1 個反應，這樣一起并排電泳時容易判斷哪個條帶是模板 DNA，哪個條帶是擴增得到的RNA。在 N+1 個 RNase-free 的塑料離心管中，在室溫下（不是在 4℃下）

按次序加入下列成分：

成分 N 個樣品管 陰性對照

DNA 模板 各 50 ng（PCR 片段模板）

或各 1μg（質(zhì)粒模板）

50 ng（PCR 片段）

1μg（質(zhì)粒 DNA）

2×T3 轉錄預配液 10 μL 10 μL

T3 RNA 聚合酶混合液 1 μL 不加

RNase-free 水 補水到 20μL 補水到 20μL

注：此為 20μL 反應體系的用量，對其他體積的反應體系，各成分的用量可以按比例增減。如果需要標記 RNA 探針，則需要另購 NTP 與 2×T3 轉錄預配液分開提供的試劑盒。如果需要得到加帽 RNA，則需要加入自備的加帽修飾核苷酸（NEB 提供各種加帽修飾核苷酸）。

2. 37℃保溫 1-2 小時。注意：延長保溫時間并不能提高產(chǎn)量。

3. 70℃加熱 10 分鐘滅活 T3 RNA 聚合酶。

4. 取 1-3μL 電泳檢測轉錄效果。比陰性對照多出的條帶就是擴增得到的 RNA（由于檢測時的電泳不需要堿變性膠，并且合成的 RNA 長度不一定均勻，即使長度均勻，但由于自生形成發(fā)夾結構，因此不一定呈現(xiàn)清晰的電泳條帶。但由于 RNA 是單鏈，分子量比同樣長度的 DNA 小一倍，因此轉錄得到的 RNA 一般比其模板電泳速度更快。

5. 定量，可以用自備的單鏈 RNA 定量試劑盒檢測濃度，也可以肉眼比較電泳膠上 RNA 和 DNA 的強度。由于 RNA 是單鏈，跟核酸染料結合力低，因此同等亮度的 RNA 條帶，其 RNA 分子數(shù)一般比 DNA 的分子數(shù)多一倍。使用本試劑盒時 1μg DNA 模板一般可以合成 2-6μg 的 RNA。

6. 得到的 RNA 可以放-80℃保存（溶液中有 DNA 模板和未使用的 NTP）。

注：若需進一步去除 T3 轉錄反應體系中的 DNA 模板，可參考下列操作步驟，但所用試劑需另行購買，本試劑盒不提供。

1. 在體外轉錄結束后，在反應體系中加入 3-5 U 自備的 RNase-free DNase。

2. 37℃保溫 15-30 分鐘。

3. 補水到 100 μL，

4. 用自備的等體積（100 μL）的Tris飽和酚-氯仿抽提一次去除殘留的DNase和 RNA 聚合酶。

5. 在上清中加 200 μL 自備的微量核酸沉淀劑（CAT#50903；用前需要搖晃混勻），振蕩后 15000 rpm 離心 3-5 分鐘，棄上清。

6. 加入 1 mL 75%乙醇，震蕩 10 秒后 15000 rpm 離心 3-5 分鐘，棄上清。

7. 短暫離心數(shù)秒，用槍頭吸棄上清。

8. 晾干半分鐘，所得沉淀即去除 DNA 模板后的 RNA?？扇苡?RNase-free水中后立即使用或放-80℃長期保存。