通用型RT-LAMP恒溫擴(kuò)增試劑盒

產(chǎn)品及特點(diǎn) 本 試 劑 盒 可 以 用 于 RT-LAMP 等 溫 擴(kuò) 增 ， RT-LAMP 即 逆轉(zhuǎn)錄和Loop-Mediated Isothermal Amplification（環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增）的結(jié)合，專門用于快速擴(kuò)增 RNA。LAMP 是 2000 年才出現(xiàn)的一種新穎的等溫核酸擴(kuò)增方法。它利用 4 或 6 條模板專一的特異引物和具有鏈置換能力的 DNA 聚合酶，在等溫條件下(63℃左右) 30－60 分鐘完成擴(kuò)增。該技術(shù)在靈敏度、特異性和檢測范圍等指標(biāo)上能媲美甚至優(yōu)于 RT-PCR 技術(shù)，同時還不需要模板的熱變性、溫度循環(huán)、電泳及紫外觀察等過程，不依賴任何專門的儀器設(shè)備。目前已成功應(yīng)用于人類及動植物、細(xì)菌、病毒、寄生蟲、真菌等病原體的快速檢測。本試劑盒即根據(jù) LAMP 原理開發(fā)，它具有下列特點(diǎn)：

1. 整合了所有成分為 2×RT-LAMP Mix，不需要單個準(zhǔn)備各成分。RT 和LAMP 一管式操作，方便快捷，減少污染。

2. 高特異性，由于同時使用 4-6 條特異引物，所以特異性比 RT-PCR 更高。

3. 高擴(kuò)增效率，擴(kuò)增效率可達(dá)到 10E9-10E10，比 PCR 靈敏 10 倍，好時可檢測到單拷貝的 RNA 分子

4. 65℃左右恒溫下完成 RT 和 LAMP 擴(kuò)增，不需要貴重的熱循環(huán)儀。。

5. 提供擴(kuò)增對照，便于在遇到困難時分析原因。

6. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20uL 體系的 RT-LAMP 擴(kuò)增，本產(chǎn)品限于科研使用。
規(guī)格及成分 成 份 編 號 塑料袋包裝
2×RT-LAMP Mix 101114a 500 uL（白蓋）
LAMP 陽性對照模板-引物混合物 130923a 45 uL（黃蓋）
使用手冊 101114sc 1 份

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期一年。

自備試劑 RNA 模板及 LAMP 引物（4 或 6 條）

使用方法

 1. 配制自備的5×LAMP引物混合液。先加超純水將自備的下列6種（或4種）引物干粉稀釋到母液濃度（見下表），然后在一新的離心管中按表中所列體積加入各種引物和超純水，后得到1mL的5×LAMP引物混合液。如果需要配制的5×LAMP引物混合液體積大于或小于1mL，則各成分的用量請按比例調(diào)整。此混合液可以在-20℃放置2年。1mL的5×LAMP引物混合液足夠250次20uL體積的LAMP或

RT-LAMP擴(kuò)增。引物名稱 母液濃度 加入母液量 在 5×LAMP 引物

混合液中的濃度

自備 FIP 引物 100 uM 80 uL 8 uM

自備 BIP 引物 100 uM 80 uL 8 uM

自備 F3 引物 100 uM 10 uL 1 uM

自備 B3 引物 100 uM 10 uL 1 uM

自備 Loop F 100 uM 20 uL 2 uM

自備 Loop B 100 uM 20 uL 2 uM

超純水 780 uL

合計(jì) 1000uL

2. 在冰上融化各組份后輕柔混勻，按下表在PCR反應(yīng)管中設(shè)置反應(yīng)，如果有N個樣品，則需要設(shè)置N+2個反應(yīng)，多的兩個一個是陽性對照，一個是陰性對照：

成份 N 個樣品管 陰性對照管 陽性對照管

2×RT-LAMP Mix 各 10 uL 10 uL 10 uL

自備 5×LAMP 引物混合液 各 4 uL 4 uL

自備 RNA 模板 各 1-100ng -

LAMP 陽性對照模板-引物

混合物

- - 4.5

補(bǔ)自備超純水到 20 uL 20 uL 20 uL

注：如果在此步少加1 uL水，然后加入自備的可視化染料（本公司有相關(guān)產(chǎn)品，

編號為130833，可到www.tiandz.com了解），則反應(yīng)后可直接肉眼判斷

LAMP擴(kuò)增是否成功。

3. 混勻，置于63℃保溫60分鐘。注意：如果不使用Loop引物，則好保溫120分鐘；如果使用Loop引物，則好保溫60分鐘。

4. 80℃10分鐘滅活Bst DNA聚合酶。BstDNA聚合酶有外切酶活性，所以必須滅活，否則它可能會逐漸降解DNA擴(kuò)增產(chǎn)物。

5. 產(chǎn)物置于-20℃?zhèn)溆没蛄⒓从糜谙掠螜z測。擴(kuò)增產(chǎn)物可選下列方法之一檢測:

1) 如果已經(jīng)加入LAMP可見光染料，則直接肉眼觀察。判斷標(biāo)準(zhǔn)見上。

2) 瓊脂糖凝膠電泳：取LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物5uL在1-2%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，如果有擴(kuò)增將可見LAMP特征性梯狀電泳圖譜；

3) 向擴(kuò)增產(chǎn)物中直接加入本公司PCR級綠如藍(lán)染料（產(chǎn)品編號70909，另售）1 uL，混勻，稍離心。如果顏色同陰性對照呈現(xiàn)淡黃色，則無擴(kuò)增。如果同陽性對照呈現(xiàn)淡綠色，表示有LAMP擴(kuò)增。也可在加入PCR級綠如藍(lán)染料后將反應(yīng)管在300nm的紫外線下觀察，如果顏色同陰性對照呈現(xiàn)弱熒光，則無擴(kuò)增。如果同陽性對照呈現(xiàn)強(qiáng)熒光，表示有LAMP擴(kuò)增。

6. 結(jié)果分析：

1) 如果陽性對照有擴(kuò)增，陰性對照沒有擴(kuò)增，則樣品數(shù)據(jù)才有效，否則實(shí)驗(yàn)失敗，不需要分析數(shù)據(jù)。

2) 如果陽性對照沒有擴(kuò)增，說明試劑盒有問題，請速跟廠家聯(lián)系。

3) 如果陰性對照有擴(kuò)增，說明有污染（過去的擴(kuò)增產(chǎn)物污染了陰性樣品），必須重新設(shè)計(jì)新的針對不同靶位點(diǎn)的LAMP引物，并且嚴(yán)格注意操作的規(guī)范性。