動(dòng)物線粒體總蛋白提取試劑盒
產(chǎn)品及特點(diǎn)線粒體是非常重要的細(xì)胞器，它不但跟很多人類疾病相關(guān)，而且還是母系遺傳研 究的重要材料。本產(chǎn)品可用于動(dòng)物細(xì)胞線粒體總蛋白的快速微量提取，可用于各種后 續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。它具有下列特點(diǎn)：

1. 即開即用，用戶不需要自己配制各種溶液，優(yōu)化各種條件。

2. 本試劑盒有粗提和精提兩個(gè)操作選項(xiàng)，但是精提需要超速離心機(jī)。粗提所得線粒 體可以直接用于蛋白分析（SDS-PAGE、Western Blot、ELISA 等）、蛋白組分 析和線粒體 DNA 純化。精提線粒體可以用于偶聯(lián)分析和體外線粒體蛋白合成等實(shí) 驗(yàn)。

3. 本產(chǎn)品一次可以處理約 2×10 8個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞，30 mg 培養(yǎng)細(xì)胞（相當(dāng)于 15 瓶 150 mm 培養(yǎng)細(xì)胞）可以純化到到 0.5-1.5 mg 線粒體。

4. 本產(chǎn)品適用于各種動(dòng)物懸浮培養(yǎng)細(xì)胞和貼壁培養(yǎng)細(xì)胞，不能用于動(dòng)物實(shí)體組織。

5. 提供線粒體染液，可以在操作中隨時(shí)監(jiān)測純化過程中線粒體的完整性。

6. 得到的總蛋白可以直接用于 SDS-PAGE、2D 電泳、免疫印跡分析、蛋白活性測 定和 BCA 法及 Lowry 法蛋白定量（不適用于 Bradford 法）。
動(dòng)物線粒體總蛋白提取試劑盒
規(guī)格及成分 成份 編號(hào) 大扁紙盒包裝
動(dòng)物線粒體純化溶液 A 130891a 50 mL
動(dòng)物線粒體純化溶液 B 130891b 250 mL×2
蔗糖 130891c 100 g（干粉瓶）
詹納斯綠 B 染色液（0.2%） 130891d 1 mL（棕色管）
蛋白微量提取溶液 A 130891e 15 mL
蛋白微量提取溶液 B 130891f 1.5 mL
使用手冊(cè) 130891sc 1 份
動(dòng)物線粒體總蛋白提取試劑盒運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸，130891e、130891f-20℃保存, 其余成分常溫保存，保存期限一年。 自備試劑 PBS 緩沖液。 
Dounce 勻漿器
3. 配制 1.0M 低比重溶液。粗提時(shí)需要低比重溶液 100mL，配制方法是將 34 克蔗糖用溶液 B 溶解并定溶到 100mL，冰上預(yù)冷待用。精提時(shí)需要低比重溶液150mL，配制方法是將 51 克蔗糖用溶液 B 溶解并定溶到 150mL，冰上預(yù)冷待用。
4. 配制線粒體重懸液。粗提時(shí)需要重懸液 200mL，配制方法是將 150 mL 溶液 B和 50 mL 1.0M 低比重溶液混合；精提時(shí)需要重懸液 300mL，配制方法是將 225mL 溶液 B 和 75 mL 1.0M 低比重溶液混合，即得 300mL 線粒體重懸液，冰上預(yù)冷待用。
二：線粒體粗提（此步驟同柱式動(dòng)物線粒體 DNAout 中線粒體提取步驟）
5. 如果提取材料是單層細(xì)胞，先用 60 mL 自備的 PBS 緩沖液洗滌 2×10
8個(gè)培養(yǎng)的單層細(xì)胞，共洗滌 2 次。然后用塑料刮匙刮下細(xì)胞，重懸在 60 mL PBS 緩沖液中。如果是懸浮細(xì)胞，則 1000g 4℃離心 10 分鐘收集 2×108 個(gè)細(xì)胞，再用60 mL PBS 緩沖液洗滌 2 次，最后將細(xì)胞重懸在 60 mL PBS 緩沖液中。
6. 用平甩轉(zhuǎn)子（swinging-bucket rotor）離心機(jī) 1000 g 4℃離心 10 分鐘，吸棄上清，保留細(xì)胞沉淀。
7. 加入 5 倍體積(以細(xì)胞沉淀的體積為基數(shù))的預(yù)冷的溶液 A，輕柔重懸細(xì)胞。
8. 冰上放置 4-5 分鐘。注意：冰浴時(shí)間不要超過 5 分鐘。
9. 如果是成纖維細(xì)胞，由于其難以裂解，可將細(xì)胞重懸液在-80℃放置 20-30 分鐘后再化凍，然后進(jìn)入下步操作。如果不是成纖維細(xì)胞，則直接進(jìn)入下步操作。
10. 將細(xì)胞重懸液體轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的 Dounce 玻璃勻漿器中（工作體積為 10-15 mL，間隙為 0.12 mm，是玻璃材質(zhì)，否則線粒體產(chǎn)率會(huì)降低）勻漿適當(dāng)次數(shù)。細(xì)胞株不同，其最適勻漿次數(shù)不同，一般需要 40 次-60 次左右。勻漿是線粒體純化最關(guān)鍵的步驟，故勻漿前先通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最適勻漿次數(shù)，方法是每勻漿5-10次后，取 2-3 uL 勻漿液到載玻片上，然后在相差顯微鏡下觀察，完整細(xì)胞數(shù)量降低到 20%以下為佳。
11. 加入 1/3 體積的、預(yù)冷的 1.0 M 低比重溶液，輕柔混勻。
12. 用平甩轉(zhuǎn)子離心機(jī) 4℃ 1000 g 離心 10 分鐘。沉淀含殘留完整細(xì)胞、細(xì)胞碎片和細(xì)胞核，上清液含線粒體。
13. 轉(zhuǎn)移上清液到離心管中，冰上放置。在顯微鏡下檢測上清液中線粒體的完整性。具體做法是先滴 50uL 左右上清液到載玻片上，再滴入 50 uL 詹納斯染液綠 B 染色液 20 分鐘，油鏡下觀察，藍(lán)綠色顆粒狀物即為線粒體。
14. 用固定角度轉(zhuǎn)子（fixed-angle rotor）離心機(jī) 4℃ 15000 g 離心 15 分鐘，棄上清，所得棕黑色沉淀即為粗提線粒體沉淀。
15. 用 10 mL 線粒體重懸液重懸線粒體，4℃ 15000 g 離心 15 分鐘，棄上清。
16. 重復(fù)上步一次。
17. 最后用適量的線粒體重懸液重懸線粒體，可用于各種后續(xù)實(shí)驗(yàn)（本試劑盒不提供相關(guān)試劑），如果用于下面的精提操作，則用 10mL 線粒體重懸液重懸。
三：線粒體精提（需要超速離心機(jī)）
18. 在跟超速離心機(jī)匹配的 50 mL 的離心管中，加入 10 mL 預(yù)冷的高比重溶液，再在上面加上 10 mL 預(yù)冷的低比重溶液，最后再加上 10 mL 線粒體粗提液。
19. 70000g 4℃離心 40 分鐘，線粒體將位于高比重溶液和低比重溶液之間區(qū)域。
20. 小心用廣口吸管吸出線粒體到新的離心管中，加入等體積的線粒體重懸液。
21. 用平甩轉(zhuǎn)子（swinging-bucket rotor）離心機(jī) 1000 g 4℃離心 10 分鐘，吸棄上清，保留線粒體沉淀。
22. 用 10 mL 線粒體重懸液重懸線粒體，在平甩轉(zhuǎn)子離心機(jī)上 4℃ 1000 g 離心 10分鐘，吸棄上清，保留線粒體沉淀。
23. 再重復(fù)上步一次。
24. 最后用適量線粒體重懸液重懸線粒體，得到線粒體精提液。可以直接用于 Lowry法蛋白濃度測定，也可以用于其他后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
四：總蛋白提取
25. 每 10mg 濕重線粒體沉淀加入 0.5 mL 蛋白微量提取溶液 A 和 50 uL 蛋白微量提取溶液 B，吹打混勻。
26. 冰上放置 30 分鐘至 1 小時(shí)至溶液變清。
27. 4℃ 12,000 g 離心 1 分鐘。
28. 將上清液轉(zhuǎn)移至一新的 1.5 mL 塑料離心管中即得到蛋白溶液，可置于-70℃冰箱保存或立即使用。如果要進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳，可取部分樣品到離心管中，加入5×SDS-PAGE 上樣緩沖液（終濃度為 1×），在沸水中處理 5 分鐘后立即上樣電泳。