DNA堿性膠上樣液,6×
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有效期:1年
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其他:
產品介紹:
用于DNA堿性膠上樣
使用方法
1. 將 50-300mg 昆蟲組織放入 10-15 mL 塑料離心管中,加入 1 mL 溶液 A,然后用勻漿器勻漿 5-20 秒。勻漿時會產生泡沫,但不影響提取效果。也可以使用液氮硯磨法破碎昆蟲組織,硯磨完后加入 1 mL 溶液 A。注意:溶解溶液 A 沉淀。溶液 A 在 4℃放置后可能會產生沉淀,使用前必須放在 65℃水浴使沉淀徹底溶解并充分搖勻后再取用。
2. 將勻漿物或硯磨物轉移至干凈的 1.5 mL 塑料離心管中(可以不必轉移非液體的細胞碎片)。
3. 在離心管中加入 0.3 mL 的溶液 B 和 0.2 mL 自備氯仿,在振蕩器上振蕩30 秒混勻,此時溶液呈均勻的乳濁狀。振蕩器振蕩時必須使管底溶液震蕩起來。
4. 室溫 12,000 rmp 離心 3-5 分鐘,兩相間將有約 5-10 毫米厚的細胞破碎物。
5. 將上清液(約 0.6 mL)轉移到另一干凈的 1.5 mL 塑料離心管中,下層有機相和中間層含有 DNA、蛋白質和其他雜質,避免觸及或吸取。好留下 100 uL上清液不取。
6. 加入等體積的溶液 C,充分顛倒混勻。
7. 將一半的溶液轉移到離心吸附柱中,12,000 rmp 室溫離心半分鐘,棄穿透液。
8. 將剩下的一半溶液轉移到同一離心吸附柱中, 12,000 rmp 室溫離心半分鐘,棄穿透液。
9. 加 0.7 mL 通用洗柱液,室溫 12,000 rmp 離心半分鐘,棄穿透液。
10. 加 0.3 mL 通用洗柱液,室溫 12,000 rmp 離心半分鐘,棄穿透液。此步可以省略。
11. 室溫 12,000 rmp 離心半分鐘。此步十分重要,否則殘留的乙醇會影響 RNA的使用。
12. 將離心吸附柱轉移到 RNase-free 收集管中,加入 50-100 uL RNA 洗脫液,室溫放置 1-2 分鐘。
13. 12,000 rmp 室溫離心半分鐘,離心管中溶液即為 RNA 樣品,可以立即使用或存放于-80℃待用。
14. RNA 完整性的電泳檢測:如果需要做 Northern 雜交,強烈建議用戶使用甲醛變性進行 RNA 電泳,因為非變性膠不能分離所有的 RNA 分子(BioTechniques,28:414,2000)。注意:大部分昆蟲的 28S RNA 被切割成兩個小的片段,彼此用氫鍵相連,所以在甲醛變性膠中,沒有 28S帶出現(文獻見:Eva C. Winnebeck,Craig D. Millar and Guy R. Warman,Why does insect RNA look degraded Journal of InsectScience: Vol. 10:1-7)
15. RNA 產量產率測定:將 5-10 μL RNA 溶于 TE 緩沖液中(pH7.5-8.2 之間)檢測其在 OD260 的光吸收。通過光吸收可以得出 RNA 濃度(1 OD260 的RNA=40 μg/mL),進而計算出 RNA 的產量(濃度 X 體積)和產率(RNA 產量/組織用量)。
16. RNA 純度測定:無污染的總 RNA 的 OD260/OD280 一般在 1.8-2.1 之間(具體數值與其堿基組成和溶液成分等多種因素有關),高于此范圍則分別表示樣品可能有蛋白質污染,但一般不影響 RT-PCR 等反應。
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