SuperTOPO-Amp平末端克隆試劑盒
產(chǎn)品及特點 本產(chǎn)品是基于 Topoisomerase 能夠在幾秒鐘之內(nèi)高速連接 DNA 片段的 原理開發(fā)的無背景克隆試劑盒，它使用了本公司通過定點突變改良的 TOPO 酶，連接效率比野生型更高。本試劑盒具有下列特點：
1. 高效快速，連接反應(yīng)幾乎在幾秒鐘內(nèi)完成，連接率幾乎達到 100%。
2. 適用于 pfu、KOD 等高保真聚合酶擴增的平末端片段的克隆。
3. 無雜帶或引物二聚體的PCR 擴增產(chǎn)物可以不經(jīng)過純化直接用于連接反應(yīng)。
4. 零背景，無需 IPTG-X-Gal 藍白斑篩選，故不需要 IPTG-X-Gal 培養(yǎng)基。
5. 本試劑盒按 10 uL 標準反應(yīng)體系，有 25 次和 50 次兩種規(guī)格包裝供選擇。
6. 提供含 Amp 和 Kan 兩種抗性的載體供選擇（160684-25A/50A 是含 Amp 抗性 TOPO 載體，160684-25K/50K 是含 Kan 抗性 TOPO 載體）。 
SuperTOPO-Amp平末端克隆試劑盒
規(guī)格及成分 成 份 編 號 25 次熱封袋包裝 50 次熱封袋包裝
SuperTOPO-Amp Blunt 載體 160684-A 25 uL（其一） 50 uL（其一）
SuperTOPO-Kan Blunt 載體 160684-K 25 uL（其一） 50 uL（其一）
連接緩沖液 160684B 25 uL 50 uL
M13F 引物 50 uL 50 uL M13R 引物 50 uL 50 uL
超純水 100935 1 mL 1 mL
使用手冊 1 份
注意：160684-25A/50A 提供 SuperTOPO-Amp Blunt 載體， 160684-25K/50K 提供 SuperTOPO-Kan Blunt 載體。 
SuperTOPO-Amp平末端克隆試劑盒運輸及保存 低溫運輸，-20℃保存，有效期一年。 自備試劑 DNA 插入片段、感受態(tài)細胞、SOB 或 LB 培養(yǎng)基（含抗菌素和不含的） 
使用方法 1. 如果是 PCR 制備插入片段，所用引物不能磷酸化，使用 pfu、KOD 等產(chǎn) 生平末端片段的高保真 DNA 聚合酶。為保證擴增產(chǎn)物的完整性，PCR 循 環(huán)結(jié)束后，再延伸 5-10 分鐘，確保片段延伸完全。
2. 電泳檢測并相對定量 PCR 片段（跟 DNA marker 比較）。根據(jù)插入片段 長度和下表確定每次連接反應(yīng)需要的用量： 
3. 在一個干凈的塑料離心管中，室溫下（不要放在冰上）設(shè)置如下連接反應(yīng) 體系： 
4. 輕柔吹打混勻后，短暫離心，常溫（20-30℃）放置 0-5 分鐘。如果在冬 天室溫低于 20℃，建議使用 25℃水浴或金屬浴。注意：連接時間超過 5 分鐘的話連接效率會降低。
5. 如果當天不轉(zhuǎn)化，可以將離心管放-20℃保存。如果轉(zhuǎn)化，則取 5 uL 連 接液加到 50-100 uL 剛剛?cè)诨母惺軕B(tài)細胞中，輕柔混勻。注意：本產(chǎn) 品要求感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化效率不得低于 5 x 10E7cfu/ug。
6. 如果片段長度小于 2 Kb，則不需要冰浴和熱激，直接在離心管中加入 500 uL 不含抗菌素的 SOC 或 LB 培養(yǎng)基，然后取 200 uL 涂盤。也可以先 3000g 離心 2 分鐘后，棄掉大部分上清，只留約 100 uL 左右，然后重 懸細菌后全部涂盤在含 Amp（對 SuperTOPO-Amp）或 Kan（對 SuperTOPO-Kan）的培養(yǎng)皿上，37℃過夜培養(yǎng)。
7. 如果片段長度長于 2 Kb，則按常規(guī)轉(zhuǎn)化方式，先冰浴 2-30 分鐘，然后 42℃熱激 30 秒，冰上防放置 2 分鐘，再在離心管中加入 500 uL 不含 抗菌素的 SOC 或 LB 培養(yǎng)基，37℃ 250 rpm 培養(yǎng) 60 分鐘，然后取 200 uL 涂盤。也可以先 3000g 離心 2 分鐘后，棄掉大部分上清，只留約 100 uL 左右，然后重懸細菌后全部涂盤在含 Amp（對 SuperTOPO-Amp Blunt 載體）或 Kan（對 SuperTOPO-Kan Blunt 載體）的培養(yǎng)皿上， 37℃過夜培養(yǎng)。
8. 用 M13F/M13R 通用引物進行菌落 PCR 或直接測序來鑒定重組子。