柱式真菌RNAout

產(chǎn)品及特點(diǎn)本產(chǎn)品本產(chǎn)品是在本公司真菌 RNAout（CAT#:60305）基礎(chǔ)上改進(jìn)的柱式產(chǎn)品，跟真菌 RNAout 相比，它具有下列特點(diǎn)：

1. 柱式操作，更加簡單快捷，整個(gè)過程只需要約 30 分鐘。

2. RNA 純度高，OD260/280 一般都在 2.0 左右，可直接用于 RT-PCR、Norther 雜交、microarrayhybridization、cDNA 合成等。

3. RNA 產(chǎn)量高，一般在 20-70 ug/mL 酵母培養(yǎng)物(約 2.0 ×107個(gè)細(xì)胞)。

4. 非酶細(xì)胞破裂法，適用于各種形態(tài)和各個(gè)種屬的真菌及革蘭氏陽性細(xì)菌，包括 Candida albicanSaccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomycespombe、Pichiapastoris、Bacillussubtilis、Staphylococcusaureus 等。
柱式真菌RNAout
規(guī)格及成分 成 分 編號(hào) 50 次包裝
溶液 A 80804A 20 mL 溶液 B 80804B 25 mL 溶液 C 80804C 75 mL 溶液 D 80804D 25 mL 離心吸附柱 60911 50 套 通用洗柱液 60408 50 mL RNA 洗脫液 71207 10 mL 使用手冊(cè) 1 份 

柱式真菌RNAout運(yùn)輸及保存 常溫運(yùn)輸，4℃保存，有效期一年。自備試劑 氯仿。

使用方法 1. 將 50 mg 左右的干菌絲(或 100 mg 左右的鮮菌絲、或適當(dāng)數(shù)量的真菌

菌落)轉(zhuǎn)移到 1.5 mL 塑料離心管中。如果是液體真菌培養(yǎng)物，則直接將

1-10 mL 液體真菌在 1.5 mL 塑料離心管中 12000-15000 g 離心 1 分鐘，并棄盡液體培養(yǎng)基（可以分多次離心）。

2. 加入 0.4 mL 溶液 A 并充分吹打混勻。如果 A 溶液存放時(shí)產(chǎn)生沉淀，請(qǐng)置于 65℃融化，用前充分搖晃均勻。

3. 加入 0.4 mL 溶液 B，劇烈振蕩 30 秒。

4. 65℃保溫 5 分鐘。

5. 室溫 12000-15000 g 離心 3-5 分鐘，轉(zhuǎn)移上清到一干凈的 1.5 mL 塑料離心管中。

6. 再加入 0.1 mL 溶液 B 和 0.1 mL 自備氯仿，振蕩混勻 30 秒。

7. 室溫12000-15000 g離心3-5分鐘，轉(zhuǎn)移上清到一自備的、干凈的5 mL塑料離心管中。

8. 加入相當(dāng)于上清 3 倍體積的溶液 C（約 1.2-1.5 mL）和 1 倍體積的溶液 D（約 0.4-0.5 mL），充分混勻。

9. 將 混合 液（約 2.5mL）分 3-4 次轉(zhuǎn) 移 到 離心 吸 附 柱 中。 每次13000-15000 g 室溫離心半分鐘，棄收集管中的穿透液。

10. 用 0.5 mL 通用洗柱液到離心吸附柱中，室溫離心半分鐘，棄收集管中的穿透液。

11. 一次洗滌一般足夠去除雜質(zhì)。但如果樣品 OD260/280 比值不高，可以再用 0.5 mL 通用洗柱液重復(fù)此步一次。

12. 室溫離心半分鐘。此步十分重要，否則殘留的洗柱液會(huì)影響 RNA 的使用。

13. 將離心吸附柱轉(zhuǎn)移到一自備的 RNase-free 1.5 mL 塑料離心管中，加入30-100 uL RNA 洗脫液。

14. 室溫離心半分鐘，離心管中溶液即為 RNA 樣品，可以立即使用或存放于-80℃待用。

15. RNA 完整性的電泳檢測(cè)：

如果需要做 Northern 雜交，強(qiáng)烈建議用戶使用甲醛變性膠進(jìn)行 RNA 電泳，因?yàn)榉亲冃阅z不能分離所有的 RNA 分子（BioTechniques，28：414，2000）。如果是簡單檢測(cè)，可以使用 TAE 或基因的SuperBuffer-2 DNA/RNA 兩用快速電泳液，但文獻(xiàn)報(bào)道必須使用變性上樣液（BioTechniques，9:558，1990）。普通 DNA 上樣液不含變性劑，也沒經(jīng)過去 RNase 處理，所以不要使用。 尤其需要注意的是不要使用 TBE 進(jìn)行 RNA 電泳，因?yàn)?TBE 所含硼酸 是研究多糖的經(jīng)典方法----硼酸絡(luò)合法中的關(guān)鍵成分，硼酸通過與 RNA 核糖中的羥基發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，形成 RNA 分子內(nèi)或 RNA 分子間的絡(luò)合復(fù) 合物，使同樣長度的RNA 具有不同的泳動(dòng)速度，電泳條帶彌散，同時(shí)有 大的 RNA 絡(luò)合復(fù)合物遲留在加樣孔中（一般會(huì)誤以為是基因組 DNA 污 染）。RNA 分子內(nèi)或RNA 分子間的絡(luò)合物的形成的多少和比例又與硼酸 與 RNA 的數(shù)量比例有關(guān)，而 RNA 樣品中污染的其他多糖也會(huì)參與此反 應(yīng)，使硼酸對(duì) RNA電泳的影響更復(fù)雜，所以 TBE 對(duì) RNA 電泳的影響 沒有規(guī)律性和重復(fù)性。有的樣品可以使用有的又不行，是避免使用。

16. RNA 產(chǎn)量產(chǎn)率測(cè)定：
將 5-10 μL RNA 溶于 TE 緩沖液中(pH7.5-8.2 之間)檢測(cè)其在 OD260的光吸收。通過光吸收可以得出 RNA 濃度（1 OD260 的 RNA=40，μg/mL），進(jìn)而計(jì)算出 RNA 的產(chǎn)量（濃度 X 體積)和產(chǎn)率(RNA 產(chǎn)量/細(xì)菌用量)。注意不要將 RNA 稀釋在 DEPC 水中檢測(cè) OD260 和 OD280，否則光吸收比在 TE 中測(cè)得的低 10%-15%。

17. RNA 純度測(cè)定：無污染的總 RNA 的 OD260/OD280 一般在 1.8-2.1 之間(具體數(shù)值與其堿基組成和溶液成分等多種因素有關(guān))，OD260/OD230 一般在2.0-2.3 之間，如果低于或高于此范圍則分別表示樣品可能有蛋白質(zhì)或多糖的污染，但一般不影響 RT-PCR 等反應(yīng)。蛋白質(zhì)污染可以通過酚/氯仿抽提一次然后酒精沉淀去除，DNA 和多糖污染可以分別用基因的 DNA Erasol 和 PS Erasol 去除。測(cè) OD 時(shí) RNA 不能過度稀釋使 OD 讀數(shù)低于儀器的有效范圍。