Protease Inhibitor Cocktail
產(chǎn)品描述
產(chǎn)品成分
| 成分 | 濃度 | 靶點(diǎn) |
| AEBSF | 104 mM | Serine proteases |
| Aprotinin | 80 μM | Serine proteases |
| Bestatin | 5 mM | Aminopeptidases |
| E-64 | 1.5 mM | Cysteine proteases |
| Leupeptin | 2 mM | Serine and cysteine proteases |
| Pepstatin A | 1.5 mM | Aspartic proteases |
產(chǎn)品細(xì)節(jié)
| 描述: | 6種廣譜蛋白酶抑制劑的混合物，保護(hù)蛋白完整性 |
| 貯存條件: | -20°C 12個月 |
| 運(yùn)輸條件: | 藍(lán)冰運(yùn)輸 |
| 注意點(diǎn): | 傳統(tǒng)的蛋白酶抑制劑(E-64, AEBSF, bestatin, leupeptin and aprotinin)是不能夠抑制某些去泛素化(DUB)蛋白酶(例如ATAXIN-3)的功能的。(參考文獻(xiàn): Neil D. Rawlings, Guy Salvesen et al. Handbook of Proteolytic Enzymes,Vol.1, 2012). |
背景知識
內(nèi)源蛋白的產(chǎn)生和降解一般都維持在一個平衡狀態(tài)，因此在穩(wěn)定的環(huán)境因素下細(xì)胞內(nèi)的蛋白含量是也是穩(wěn)定的。但是在體外研究中，蛋白合成過程終止，而降解大大增強(qiáng),從而影響蛋白得率。因此我們建議使用多種小分子組成的抑制劑混合物來抑制蛋白酶的功能，阻止蛋白降解情況的發(fā)生。
實(shí)驗(yàn)方法
應(yīng)用領(lǐng)域
蛋白純化，蛋白免疫印跡, 免疫(共)沉淀，蛋白質(zhì)pull-down實(shí)驗(yàn)，免疫熒光，免疫組織化學(xué)，激酶測定等。
使用方法
在室溫下溶解DMSO儲液， 在您的實(shí)驗(yàn)體系中，按照1：100的比率(體積比體積)將抑制劑cocktail加入到樣品溶液中(比如細(xì)胞裂解液或者組織抽提物)。
常見問題：
問題1: 為什么要用蛋白酶抑制劑Cocktail？
回答1: 蛋白酶抑制劑Cocktail是低毒，全面的蛋白保護(hù)試劑，限度地保護(hù)蛋白，使其免于被蛋白酶降解。目前生物學(xué)研究日漸深入，更多地將目標(biāo)鎖定為細(xì)胞中較為微量的蛋白，如信號通路蛋白、受體蛋白，采用coIP,Pull-down等方法獲得樣品。對于這些微量的珍貴樣品，Cocktail能取得的保護(hù)效果，比單一的抑制劑（如PMSF）更為可靠。
問題2: 蛋白酶抑制劑Cocktail能否稀釋使用？
回答2: 蛋白酶活性抑制效果和很多因素有關(guān)，如目標(biāo)蛋白降解的難易程度、蛋白酶的濃度、活性、抑制劑的濃度都會影響最后的保護(hù)效果。我們的蛋白酶抑制劑Cocktail采用經(jīng)典濃度配比，確保對不同類型的蛋白酶都有充分的抑制效果。為了取得的保護(hù)效果，使用時應(yīng)按照規(guī)定比例稀釋，這是此類產(chǎn)品的共性。但實(shí)際產(chǎn)品里，不同廠商的標(biāo)示清楚程度不同，有些友商的對稀釋操作描述不嚴(yán)謹(jǐn)，很容易產(chǎn)生可以稀釋使用的誤導(dǎo)，需要仔細(xì)辨讀，以免影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在部分實(shí)驗(yàn)室實(shí)際應(yīng)用中，也存在對于已知蛋白的成熟操作流程中減量使用cocktail的情況，對于這類應(yīng)用，Biotool可對照同類產(chǎn)品的相同比例稀釋使用，可以保證保護(hù)效果。
問題3: 實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常用PMSF來保護(hù)蛋白，蛋白酶抑制劑Cocktail和它比有什么優(yōu)勢？
回答3: PMSF是經(jīng)典的絲氨酸蛋白酶抑制劑，以前被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞裂解純化蛋白過程。但由于PMSF在很多方面存在明顯的缺點(diǎn)，逐步被保護(hù)效果更好，更安全的蛋白酶抑制劑Cocktail所取代。PMSF的毒性較高，因此在蛋白酶抑制劑中選用AEBSF作為其替代品。AEBSF的半致死量是2834mg/kg，而PMSF是200mg/kg，AEBSF安全域值超過PMSF十四倍多，同時有著相當(dāng)?shù)囊种菩Ч?，對于很多絲氨酸蛋白酶的抑制比PMSF更為迅速。PMSF的另一個缺點(diǎn)是易降解失效，它在水溶液中的半衰期是30min，在細(xì)胞裂解過程中很容易失效。而蛋白酶抑制劑Cocktail不但保護(hù)更加全面，而且效果更加持久。
問題4: 我應(yīng)該選擇哪種類型的蛋白酶抑制劑cocktail， 片劑還是溶液？
回答4: 在選擇cocktail產(chǎn)品類型的時候我們需要注意一些細(xì)節(jié)問題。兩種類型的產(chǎn)品都含有添加物。片劑中含有若干種公司專利的未經(jīng)公開的醫(yī)藥成分， 而溶液型產(chǎn)品中含有溶劑成分DMSO。一般來說這些添加物是不會影響產(chǎn)品效果的。在工業(yè)生產(chǎn)中，溶液型產(chǎn)品較片劑來說需要的加工步驟少，因而質(zhì)量好價格低。而片劑產(chǎn)品在儲存和運(yùn)輸兩個環(huán)節(jié)具有優(yōu)勢，片劑能夠在4度儲存而不需要零下20度。我們推薦使用溶液型產(chǎn)品，價格更低，有效的抑制劑成分含量更高，便于直接分裝。
問題5: DMSO會不會對我的實(shí)驗(yàn)造成影響？
回答5: DMSO會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可能性很低。在生物科學(xué)領(lǐng)域DMSO被作為很多生物活性物質(zhì)的溶劑，比如蛋白結(jié)晶和免疫共沉淀等要求較高的實(shí)驗(yàn)體系中DMSO也有應(yīng)用。DMSO在室溫下性質(zhì)穩(wěn)定，在低溫條件下DMSO還是優(yōu)秀的細(xì)胞冷凍保護(hù)劑。
問題6: 用了Cocktail，結(jié)果仍然不好是怎么回事？
回答6: 蛋白酶抑制劑Cocktail作用是保護(hù)蛋白免受蛋白酶降解威脅，提高蛋白得率。對于絕大多數(shù)蛋白，Cocktail都有很好的效果。如果還是出現(xiàn)蛋白得率低的情況，需要謹(jǐn)慎檢查實(shí)驗(yàn)步驟和方案設(shè)計，限度發(fā)揮Cocktail作用，減少導(dǎo)致蛋白降解的環(huán)節(jié)。例如，細(xì)胞處理前，先要將裂解體系完全準(zhǔn)備好，預(yù)先加入Cocktail并混勻，將要破碎的細(xì)胞，收集完后或從冰箱中取出后立即加入準(zhǔn)備好的裂解液中，給予蛋白全程保護(hù)。
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溫馨提示：不可用于臨床治療。