產(chǎn)品簡(jiǎn)介

抗酒石酸酸性磷酸酶檢測(cè)試劑盒(Tartrate Resistnt Acid Phosphatase Colorimetric Assay Kit)檢測(cè)原理是利用Para-nitrophenyl phosphate(pNPP)為一種常用的磷酸酶顯色底物，在酸性條件下，可在酸性磷酸酶的作用下生成p-nitrophenol。在堿性條件下p-nitrophenol呈黃色，產(chǎn)物黃色越深，說(shuō)明酸性磷酸酶活性越高，反之則酶活性越低，通過(guò)分光光度比色法(酶標(biāo)儀)測(cè)定吸光度，據(jù)此通過(guò)比色分析就可以計(jì)算出酸性磷酸酶活性水平。在適量的酒石酸存在的情況下進(jìn)行酸性磷酸酶的活性檢測(cè)，檢測(cè)得到的酸性磷酸酶的活性就是抗酒石酸酸性磷酸酶的活性。該試劑盒可用于檢測(cè)細(xì)胞或組織的裂解液或勻漿液、血漿、血清、尿液等樣品中內(nèi)源性的抗酒石酸酸性磷酸酯酶活性。該試劑盒僅用于科研領(lǐng)域，不宜用于臨床診斷或其他用途。

試劑組分：

自備材料：

1、PBS 或生理鹽水

2、離心管

3、水浴鍋或恒溫箱

4、96 孔板、酶標(biāo)儀

操作步驟(僅供參考)：

1、準(zhǔn)備樣品：

①血漿、血清和尿液樣品：血漿、血清按照常規(guī)方法制備后可以直接用于本試劑盒的測(cè)定，尿液通常也可以直接用于測(cè)定，-20℃凍存，用于抗酒石酸酸性磷酸酶的檢測(cè)。

②細(xì)胞或組織樣品：取恰當(dāng)細(xì)胞或組織裂解液，如果有必要可用 PBS 或生理鹽水進(jìn)行適當(dāng)勻漿，一般細(xì)胞數(shù)量在 10 6 以上，組織應(yīng)在 100mg 以上，3000~4000g 離心取上清，-20℃凍存，用于抗酒石酸酸性磷酸酶的檢測(cè)。

③植物樣品：取適量的植物組織加入少量 PBS 或生理鹽水，充分搗碎或研磨，靜置 30min，用紗布或?yàn)V紙過(guò)濾，4000g 離心 20min，留取上清液并測(cè)量體積，-20℃凍存，用于抗酒石酸酸性磷酸酶的檢測(cè)。

④高活性樣品：如果樣品中含有較高活性的抗酒石酸酸性磷酸酶，可以使用 ACP Assay buffer、PBS 或生理鹽水稀釋后再行檢測(cè)。

2、配制顯色工作液： 取出 1 支 pNPP，恢復(fù)至室溫后溶解于 2.5ml ACP Assay buffer，混勻，冰上預(yù)冷備用，新配制的顯色工作液應(yīng)在 6h 內(nèi)用完。

3、配制系列標(biāo)準(zhǔn)品：取出 p -nitrophenol(10mM)恢復(fù)至室溫，按 p -nitrophenol(10mM)：ACP Assay buffer=1：19 的比例混合，使?jié)舛冗_(dá)到 0.5mM，-20℃凍存?zhèn)溆谩０聪卤砝^續(xù)稀釋?zhuān)?/span>

4、TRAP 加樣：按按照下表設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、空白孔，溶液應(yīng)按照順序依次加入，并注意避免產(chǎn)生氣泡。如果樣品中的 TRAP 活性過(guò)高，可以減少樣品用量或適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行測(cè)定，樣品的檢測(cè)能設(shè)置平行孔。

6、TRAP 測(cè)定：輕輕混勻，37℃孵育 25～30min，每孔加入 160μl Stopping Solution 終止反應(yīng)。以空白調(diào)零，酶標(biāo)儀測(cè)定 405nm 處標(biāo)準(zhǔn)管、測(cè)定管的吸光度。

計(jì)算：

計(jì)算： 酸性磷酸酶活性單位的定義：在 pH4.8 37℃條件下，每分鐘水解 para-nitrophenyl phosphate 顯色底物產(chǎn)生 1 微摩爾 p -nitrophenol 所需的酸性磷酸酶的量定義為一個(gè)酶活力單位。根據(jù)酶活性定義，計(jì)算出樣品中的抗酒石酸酸性磷酸酶活性。系列標(biāo)準(zhǔn)品(1~6 號(hào))濃度(即 p -nitrophenol 含量)50、100、200、300、400、500μ

M 為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)孔吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)測(cè)定孔的吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得待測(cè)樣品的含量。

注意事項(xiàng)：

1、待測(cè)樣品中不能含有磷酸酶抑制劑，同時(shí)需避免反復(fù)凍融。

2、如果待測(cè)樣品體積較少，可減少樣品加樣量，以 ACP Assay buffer 補(bǔ)至 30μl。

3、如果無(wú)法檢測(cè) 405nm，亦可檢測(cè) 400～415nm 范圍內(nèi)吸光度。

4、建議每次測(cè)定時(shí)都作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以使標(biāo)準(zhǔn)更準(zhǔn)確，另外標(biāo)準(zhǔn)品避免反復(fù)凍融。

5、如果沒(méi)有酶標(biāo)儀，也可以使用普通的分光光度計(jì)測(cè)定，但應(yīng)考慮根據(jù)比色杯的最小檢測(cè)體積，盡量采用小體積的比色杯。

6、所測(cè)樣品的含量高于標(biāo)準(zhǔn)曲線的上限，應(yīng)用 ACP Assay buffer 稀釋樣品后重新測(cè)定。

7、配制 1 支顯色工作液后應(yīng)當(dāng)日用完，因此請(qǐng)注意適當(dāng)多準(zhǔn)備一些樣品一起檢測(cè)。

8、p -nitrophenol 溶液對(duì)人體有害，反應(yīng)終止液有腐蝕性，請(qǐng)小心操作。

9、如果希望進(jìn)行酶活性的絕對(duì)定量，進(jìn)行酶反應(yīng)時(shí)應(yīng)精確計(jì)時(shí)，此時(shí)推薦采用孵育 30min或更長(zhǎng)時(shí)間，以減小操作過(guò)程中的時(shí)間誤差。

10、待測(cè)樣品中抗酒石酸酸性磷酸酶活性較低時(shí)，可適當(dāng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間至 30min。

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