名稱 NP-40裂解液 / NP-40 Lysis Buffer
規(guī)格 PH1421-100 | 100mL
存儲 冰袋運輸,-20℃保存
有效期:至少12個月
試劑組份
試劑A:NP-40 Lysis Buffer----100ml----Store at -20℃
試劑B:PMSF(100mM)----1.5ml----Store at -20℃
產(chǎn)品簡介
NP-40 Lysis Buffer主要由Tris-HCl、NaCl、NP-40等組成。用本裂解液得到的蛋白樣品,可以用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。由于含有較高濃度的去垢劑,不能用Bradford法測定由本裂解液裂解得到樣品的蛋白濃度。
NP-40裂解液 (NP-40 Lysis Buffer)是采用一種溫和的裂解方法獲得總蛋白的裂解液。所獲得的蛋白質(zhì)可以用于PAGE電泳、Western、免疫沉淀(Immunol Precipitation,IP)和免疫共沉淀(co-IP)等。
使用說明
(一)貼壁培養(yǎng)細(xì)胞
1.取NP-40 Lysis Buffer 置于室溫溶解混勻,加入PMSF,使PMSF終濃度為1mM。例如取每1ml RIPA 加入10ul PMSF,使PMSF的最終濃度為1mM,混勻備用 (PMSF現(xiàn)用現(xiàn)加)。
2.去除貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)液,用PBS、NS或無血清培養(yǎng)液清洗1次,低速離心,棄上清,留取沉淀。
3.按照6孔板每孔加入150~250μl含有PMSF的裂解液的比例,加入NP-40 Lysis Buffer 。移液器輕輕吹打,使裂解液和細(xì)胞充分接觸。置于冰上或4℃裂解15~30min,通常裂解液作用于細(xì)胞1~3s內(nèi),細(xì)胞就會被裂解。
4.10000~12000g,4℃離心5~10min(如無低溫離心機,室溫下離心亦可),取上清。
5.進行后續(xù)的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
(二)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞
1.取NP-40 Lysis Buffer 置于室溫溶解混勻,加入PMSF,使PMSF終濃度為1mM。低速離心懸浮細(xì)胞,棄上清,收集沉淀。
2.用手指輕彈細(xì)胞,使其松散。按照6孔板每孔細(xì)胞加入150~200μl含有PMSF的裂解液的比例,加入NP-40 Lysis Buffer。通常6孔板每孔細(xì)胞加入150μl裂解液已經(jīng)足夠,但如果細(xì)胞密度非常高可以適當(dāng)加大裂解液的用量到200~250μl。再用手指輕彈以充分裂解細(xì)胞,充分裂解后應(yīng)沒有明顯的細(xì)胞沉淀。
3.10000~12000g,4℃離心5~10min(如無低溫離心機,室溫下離心亦可),取上清。
4.進行后續(xù)的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
(三)組織樣本
1.取NP-40 Lysis Buffer 置于室溫溶解混勻,加入PMSF,使PMSF終濃度為1mM。把組織剪切成細(xì)小的碎片,越小越好。
2.取在液氮或超低溫冰箱中冷凍30min以上的組織,迅速用液氮研磨,研磨過程盡量控制在1~2min之內(nèi),以減少蛋白的降解。
3.按照每20mg組織加入150~250μl裂解液的比例加入含有PMSF的裂解液。冰上或4℃裂解30~60min。
4.步驟3、4亦可以采用如下過程:按照每20mg組織加入150~250μl裂解液的比例,加入含有PMSF的NP-40 Lysis Buffer。用玻璃勻漿器或組織研磨器勻漿,直至充分裂解,該過程盡量控制在1~2min之內(nèi),以減少蛋白的降解。
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