上海澤葉生物科技有限公司專注高品質(zhì)的免疫學(xué)產(chǎn)品并代理：
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提供針對人源,大鼠，小鼠等種屬蛋白的多種單抗及多抗產(chǎn)品，可以應(yīng)用于多種實驗。
一，動物的免疫
選擇合適的免疫方案對于細(xì)胞融合雜交的成功，獲得高質(zhì)量的McAb至關(guān)重要。一般要在融合前兩個月左右確立免疫方案開始初次免疫，免疫方案應(yīng)根據(jù)抗原的特性不同而定。
1. 顆粒性抗原免疫性較強(qiáng)，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果。下面以細(xì)胞性抗原為例的免疫方案:
2. 可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐劑，常用佐劑：福氏完全佐劑，福氏不完全佐劑。要求抗原和佐劑等體積混合在一起，研磨成油包水的乳糜狀，放一滴在水面上不易馬上擴(kuò)散呈小滴狀表明已達(dá)到油包水的狀態(tài)。商品化福氏完全佐劑在使用前須振搖，使沉淀的分枝桿菌充分混勻。
初次免疫 Ag 1～50μg 加福氏完全佐劑皮下多點(diǎn)注射
│ (一般0.8～1ml 0.2ml／點(diǎn))
↓3周后
第二次免疫 劑量同上，加福氏不完全佐劑皮下或ip
│ (ip劑量不宜超過0.5ml)
↓3周后
第三次免疫 劑量同上，不加佐劑，ip
│ (5～7天后采血測其效價，檢測免疫效果)
↓2～3周后
加強(qiáng)免疫，劑量50～500μg為宜，ip或iv
↓3天后
取脾融合
目前，用于可溶性抗原(特別是一些弱抗原)的免疫方案也不斷有所更新，如①將可溶性抗原顆?；蚬滔嗷环矫嬖鰪?qiáng)了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改變抗原注入的途徑，基礎(chǔ)免疫可直接采用脾內(nèi)注射。③使用細(xì)胞因子作為佐劑，提高機(jī)體的免疫應(yīng)答水平，促進(jìn)免疫細(xì)胞對抗原反應(yīng)性。
二，融合與篩選
最重要的一步是融合，我想這也是單抗制備過程中最難的一步了。
(一) 細(xì)胞融合流程
1 取對數(shù)生長的骨髓瘤細(xì)胞SP2／0，1000rpm離心5分鐘，棄上清，用不完全培養(yǎng)液混懸細(xì)胞后計數(shù)，取所需的細(xì)胞數(shù)，用不完全培養(yǎng)液洗滌2次。
2 同時制備免疫脾細(xì)胞懸液，用不完全培養(yǎng)液洗滌2次。
3 將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起，在50ml塑料離心管內(nèi)用不完全培養(yǎng)液洗1次，1200rpm,8分鐘。
4 棄上清，用滴管吸凈殘留液體，以免影響PEG的濃度。
5 輕輕彈擊離心管底，使細(xì)胞沉淀略加松動。
6 在室溫下融合:
①30秒內(nèi)加入預(yù)熱的1ml45％PEG(Merek,分子量4000)含5％DMSO，邊加邊攪拌。
② 作用90秒鐘，若冬天室溫較低時可延長至120秒鐘。
③ 加預(yù)熱的不完全培養(yǎng)液，終止PEG作用，每隔２分鐘分別加入1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和10ml。
7 離心，800rpm，6分鐘。
8 棄上清，先用6ml左右20％小牛血清RPMI1640輕輕混懸，切記不能用力吹打，以免使融合在一起的細(xì)胞散開。
9 根據(jù)所用96孔培養(yǎng)板的數(shù)量，補(bǔ)加完全培養(yǎng)液，10ml一塊96孔板。
10 將融合后細(xì)胞懸液加入含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板，100μl／孔，37℃、5％CO2孵箱培養(yǎng)。
一般一塊96孔板含有1×107脾細(xì)胞。
三、抗體的鑒定
篩選雜交瘤細(xì)胞通過選擇性培養(yǎng)而獲得雜交細(xì)胞系中，僅少數(shù)能分泌針對免疫原的特異性抗體。一般在雜交瘤細(xì)胞布滿孔底1／10面積時，即可開始檢測特異性抗體，篩選出所需要的雜交瘤細(xì)胞系。
檢測抗體的方法應(yīng)根據(jù)抗原的性質(zhì)、抗體的類型不同，選擇不同的篩選方法，一般以快速、簡便、特異、敏感的方法為原則。
常用的方法有:
1. ELISA用于可溶性抗原(蛋白質(zhì))、細(xì)胞和病毒等McAb的檢測。
2. RIA用于可溶性抗原、細(xì)胞McAb的檢測。
3. FACS(熒光激活細(xì)胞分類儀)用于檢查細(xì)胞表面抗原的McAb檢測。
4. IFA用于細(xì)胞和病毒McAb的檢測。
可靠的篩選方法必須在融合前建立，避免由于方法不當(dāng)貽誤整個篩選時機(jī)。
四、性質(zhì)檢測
對制備的McAb進(jìn)行系統(tǒng)的鑒定是十分必要的。應(yīng)對其做如下方面的鑒定:
1. 抗體特異性的鑒定：除用免疫原(抗原)進(jìn)行抗體的檢測外，還應(yīng)用與其抗原成分相關(guān)的其它抗原進(jìn)行交叉試驗，方法可用ELISA、IFA法。例如①制備抗黑色素瘤細(xì)胞的McAb，除用黑色素瘤細(xì)胞反應(yīng)外，還應(yīng)用其它臟器的腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞進(jìn)行交叉反應(yīng)，以便挑選腫瘤特異性或腫瘤相關(guān)抗原的單克隆抗體。② 制備抗重組的細(xì)胞因子的單克隆抗體，應(yīng)首先考慮是否與表達(dá)菌株的蛋白有交叉反應(yīng)，其次是與其它細(xì)胞因子間有無交叉。