??????碧云天的Rat Insulin ELISA Kit (Rat Insulin Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Kit)，即大鼠胰島素酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒，是一種用于特異性地超高靈敏地定量檢測(cè)大鼠血清、血漿、細(xì)胞或組織裂解液、或細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的胰島素的ELISA試劑盒。最少5μl大鼠血清即可檢測(cè)，5μl普通大鼠血清可以導(dǎo)致吸光度比本底增加約0.1(不同大鼠略有不同)，使用10μl大鼠血清檢測(cè)可以獲得非常理想的檢測(cè)數(shù)據(jù)。本試劑盒不僅適用于常規(guī)的大鼠血清胰島素水平檢測(cè)，還特別適合于糖耐量實(shí)驗(yàn)(Glucose tolerance test, GTT)時(shí)測(cè)定每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血清胰島素水平。
??????本產(chǎn)品檢測(cè)靈敏度高，特異性強(qiáng)，重復(fù)性好。最小檢出量為0.1ng/ml，10μl 0.1ng/ml大鼠胰島素標(biāo)準(zhǔn)品可以導(dǎo)致吸光度比本底增加約0.07。與IGF-I、IGF-II、大鼠C肽、大鼠C肽均沒(méi)有交叉反應(yīng)，與豬胰島素、綿羊胰島素、小鼠胰島素、牛胰島素及人胰島素分別有628%、256%、75%、110%和195%交叉反應(yīng)。板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%。
??????Insulin即胰島素，是由胰臟內(nèi)的胰島β細(xì)胞分泌產(chǎn)生的，分子量約5.8kDa。胰島β細(xì)胞首先合成含有信號(hào)肽(24個(gè)氨基酸殘基)的前胰島素原(preproinsulin)，該信號(hào)肽將前胰島素原定位到粗面型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。前胰島素原的信號(hào)肽被剪切后形成胰島素原(proinsulin)，并被釋放到粗面型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)，隨后在其中形成3個(gè)二硫鍵并正確折疊。隨后胰島素原進(jìn)入高爾基體，經(jīng)蛋白水解酶的作用，生成C肽(C-peptide)和由A鏈和B鏈通過(guò)兩個(gè)二硫鍵連接起來(lái)的胰島素。1923年和1958年，胰島素的發(fā)現(xiàn)和其氨基酸序列測(cè)定都獲得了諾貝爾獎(jiǎng)。1965年，中國(guó)科學(xué)家實(shí)現(xiàn)人工全合成結(jié)晶牛胰島素，也是生命科學(xué)史上的重要成果。胰島素的分泌主要受血糖水平的調(diào)控，血液中葡萄糖水平升高時(shí)，更多的葡萄糖通過(guò)GLUT2進(jìn)入β細(xì)胞，并產(chǎn)生更多的ATP，ATP水平的升高導(dǎo)致ATP敏感的SUR1/Kir6.2鉀離子通道關(guān)閉，使細(xì)胞內(nèi)鉀離子集聚，從而引起細(xì)胞膜去極化，引發(fā)電壓門(mén)(voltage-gated)鈣離子通道打開(kāi)，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，最終導(dǎo)致胰島素的分泌。胰島素的分泌分為兩個(gè)時(shí)段，個(gè)時(shí)段通常受血糖調(diào)控，持續(xù)時(shí)間約為10分鐘；第二個(gè)時(shí)段是一個(gè)比較持續(xù)和緩慢的過(guò)程，通常分泌的高峰出現(xiàn)在個(gè)時(shí)段后的2-3小時(shí)，并且不受血糖水平影響。胰島素的分泌不僅受葡萄糖調(diào)控，也受乳糖、核糖、精氨酸和亮氨酸等氨基酸、副交感神經(jīng)釋放的乙酰膽堿、腸道分泌的腸促胰島素(incretin)例如glucagon-like peptide-1 (GLP-1)和glucose-dependent insulinotropic peptide (GIP)、膽囊收縮素(cholecystokinin)、促胰島素分泌的磺脲(sulfonylruea)類藥物等的影響。胰島素的釋放可被緊張時(shí)釋放的去甲腎上腺素(norepinephrine)、交感神經(jīng)釋放的兒茶酚胺(catecholamine)、以及胰高血糖素等所抑制。

圖1. Insulin的信號(hào)通路示意圖

??????Insulin的信號(hào)通路是一個(gè)比較復(fù)雜的信號(hào)通路，主要是胰島素與屬于酪氨酸激酶的胰島素受體(Insulin receptor)結(jié)合，從而激活PI(3)K-Akt信號(hào)通路。Insulin的信號(hào)通路參見(jiàn)圖1。
??????胰島素的主要生物學(xué)功能是降低血糖，促進(jìn)合成代謝。胰島素可以促進(jìn)肝臟、肌肉、脂肪等器官和組織的葡萄糖攝入，抑制糖異生(gluconeogenesis)，促進(jìn)糖原合成等。同時(shí)胰島素也可促進(jìn)脂質(zhì)合成和儲(chǔ)存，抑制脂質(zhì)分解，促進(jìn)蛋白合成并抑制蛋白降解，促進(jìn)DNA和RNA合成，抑制自噬(autophagy)。胰島素分泌不足或胰島素敏感性下降，導(dǎo)致不能有效降低血糖，是糖尿病發(fā)生的主要原因。胰島素分泌過(guò)量時(shí)，會(huì)導(dǎo)致低血糖，甚至出現(xiàn)驚厥、昏迷和休克。
??????本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法(Sandwich ELISA)檢測(cè)樣品中靶蛋白的的濃度，其原理見(jiàn)圖2。靶蛋白特異的單克隆捕獲抗體已預(yù)包被于酶標(biāo)板上，當(dāng)加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品時(shí)，其中的靶蛋白會(huì)與捕獲抗體結(jié)合。當(dāng)加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記靶蛋白抗體后，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記靶蛋白抗體與靶蛋白結(jié)合，形成夾心的免疫復(fù)合物。最后加入顯色劑TMB溶液，固相捕獲的辣根過(guò)氧化物酶就會(huì)催化無(wú)色的顯色劑氧化成藍(lán)色物質(zhì)，在加入終止液后呈黃色。通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm處的吸光度值就能實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。靶蛋白濃度與A450值呈正比，通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)照樣品吸光度值，即可計(jì)算出樣品中靶蛋白濃度。

圖2. 雙抗體夾心ELISA原理圖。

??????一個(gè)包裝的本試劑盒，包括標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)，可以進(jìn)行96次檢測(cè)。
包裝清單：

保存條件：
??????除標(biāo)準(zhǔn)品外，4℃保存6個(gè)月內(nèi)有效。標(biāo)準(zhǔn)品4℃保存，1-2周內(nèi)有效，-20℃保存6個(gè)月內(nèi)有效。注意TMB溶液避光保存。
注意事項(xiàng)：
??????由于標(biāo)準(zhǔn)品一般是凍干粉，在制備后需要嚴(yán)格校準(zhǔn)，所以標(biāo)準(zhǔn)品的瓶數(shù)及每瓶標(biāo)準(zhǔn)品所需加入的稀釋液體積請(qǐng)以實(shí)際收到的試劑盒及標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)簽上的標(biāo)注為準(zhǔn)。
??????洗滌液(20X)在低溫下可能有結(jié)晶，如果發(fā)現(xiàn)有結(jié)晶，請(qǐng)室溫水浴加熱使結(jié)晶完全溶解后再配制工作液。
??????為保證標(biāo)準(zhǔn)品的精確性，標(biāo)準(zhǔn)品配制使用后，如果有剩余請(qǐng)勿再次使用。
??????TMB對(duì)人體有刺激性，請(qǐng)注意適當(dāng)防護(hù)。
??????如果發(fā)現(xiàn)TMB辣根過(guò)氧化物酶顯色液出現(xiàn)混濁或顏色變成藍(lán)色，應(yīng)該停止使用。
??????加樣時(shí)，請(qǐng)注意每個(gè)樣品或標(biāo)準(zhǔn)品必須更換槍頭，一方面避免交叉污染，另一方面也避免吸取體積的誤差。
??????不宜混用不同批號(hào)的試劑盒組份，每批次試劑盒均經(jīng)過(guò)獨(dú)立測(cè)試。
??????充分混勻?qū)ΡＷC反應(yīng)結(jié)果的精準(zhǔn)性很重要，在加液后請(qǐng)輕輕晃動(dòng)整個(gè)96孔板，以保證混勻。
??????本試劑盒很多操作在室溫進(jìn)行，要求嚴(yán)格控制室溫在25-28℃。溫度低于25℃會(huì)導(dǎo)致最終檢測(cè)到的吸光度顯著下降。
??????洗滌過(guò)程非常重要，洗滌不充分會(huì)使精確度下降并導(dǎo)致結(jié)果誤差較大。
??????檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品時(shí)建議設(shè)置重復(fù)孔，以確保檢測(cè)結(jié)果的可信度。
??????加樣過(guò)程中須避免氣泡的產(chǎn)生。
??????本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
??????為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。