概述

得益于高通量測序技術(shù)和生物信息學(xué)的發(fā)展，研究人員已經(jīng)可以在較短時間內(nèi)完成整個基因組測序工作。然而，如何快速高效的實現(xiàn)基因功能研究，仍然面臨很大的挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)基因功能的篩查方法主要通過RNA干擾技術(shù)（RNAi）在后轉(zhuǎn)錄水平實現(xiàn)基因表達的敲低。近期，已有報道利用在鏈球菌中發(fā)現(xiàn)的 CRISPR/Cas9 系統(tǒng) 成功實現(xiàn)了哺乳動物基因組的定點編輯。CRISPR/Cas9系統(tǒng)是一種由RNA引導(dǎo)Cas9蛋白對靶基因進行修飾的技術(shù)。將該系統(tǒng)中的Cas9酶或經(jīng)遺傳修飾的Cas9酶與基因組規(guī)模的gRNA文庫相結(jié)合，可實現(xiàn)全基因組的基因敲除或基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，用于各種高通量篩選。例如在正向篩選中，可以用來篩選哪些基因的突變引起細胞對藥物、毒素、病原體等產(chǎn)生耐受性。一個最簡單的例子是，當(dāng)細胞轉(zhuǎn)入Cas9-gRNA文庫后，加入炭疽毒素處理，存活下來的細胞即是基因突變引起對炭疽毒素的耐藥性，利用高通量測序分析毒素處理前后gRNA豐度變化，即可確定發(fā)生突變的基因。在負向篩選中，該系統(tǒng)可用于確定哪些基因?qū)Σ煌奶幚矸绞礁鼮槊舾小Ｒ粋€最簡單的例子是，當(dāng)細胞轉(zhuǎn)入Cas9-gRNA文庫后，比較存活時間不同的細胞中g(shù)RNA豐度，存活時間短的細胞中，由gRNA-Cas9引起突變的基因很可能是與細胞增殖相關(guān)。負向篩選一個很重要的用途是用來確定不同狀態(tài)的癌細胞中存在哪些致癌基因的突變，這些突變的基因很可能成為癌癥治療的靶點。CRISPR/Cas9技術(shù)使基因編輯變得更為便捷并且高效。與高通量測序相結(jié)合，不但可以使研究者快速高效地得到一些實驗結(jié)果，也拓寬了這一技術(shù)的應(yīng)用范圍。例如，在藥物開發(fā)中可用于快速發(fā)現(xiàn)藥物的靶標并進行有效、直觀的驗證。這對探究藥物的藥理、毒理或細胞的抗藥機理提供了巨大幫助。再如，美國科學(xué)家等利用這一技術(shù)在非小細胞肺癌（NSCLC）小鼠模型的細胞中，系統(tǒng)地敲除整個基因組的所有基因，隨后將這些細胞移植到小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)用這一基因敲除文庫處理的一些細胞形成了高轉(zhuǎn)移性腫瘤，篩查出一些與腫瘤進化和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因，該方法將為在其他細胞類型和疾病中從事類似的研究鋪平道路。因此，對于那些我們不了解發(fā)生機制或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制的疾病，我們可以通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)進行高通量基因敲除篩選，探究影響疾病發(fā)生的關(guān)鍵部件及可能的發(fā)生機制，發(fā)現(xiàn)新的具有潛力的藥物靶點。

技術(shù)原理

預(yù)測靶標基因并設(shè)計gRNA序列后利用芯片合成方法合成gRNA序列。構(gòu)建gRNA文庫，利用 慢病毒 載體將所有g(shù)RNA轉(zhuǎn)入目的細胞中（低的MOI值）。通過相應(yīng)處理（如加藥處理），利用高通量測序技術(shù)檢測處理前后細胞中g(shù)RNA豐度變化，推斷基因功能與細胞表型之間的對應(yīng)關(guān)系。

解決方案

合生基因可根據(jù)客戶需求構(gòu)建shRNA文庫和gRNA文庫，包括特定細胞的全基因組基因沉默、基因敲除、基因轉(zhuǎn)錄激活和轉(zhuǎn)錄抑制文庫；同時提供利用shRNA文庫或gRNA文庫進行高通量基因編輯，以及利用高通量基因編輯技術(shù)進行與疾病相關(guān)的藥物靶基因篩查服務(wù)。合生基因擁有一支具有豐富經(jīng)驗的CRISPR基因編輯經(jīng)驗的技術(shù)團隊，可以為客戶提供全方位的基因功能研究解決方案。