??????碧云天生產(chǎn)的雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒(Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit)，是先以螢光素(luciferin)為底物來檢測螢火蟲螢光素酶(Firefly luciferase)，后以腸腔素(coelenterazine)為底物來檢測海腎螢光素酶(Renilla luciferase)，并且在后續(xù)加入海腎螢光素酶底物時，同時加入抑制螢火蟲熒光素酶催化luciferin發(fā)光的物質(zhì)，使后續(xù)檢測僅僅檢測到海腎螢光素酶的活性，實現(xiàn)雙螢光素酶報告基因檢測。
??????螢火蟲螢光素酶是一種分子量約為61kD的蛋白，在ATP、鎂離子和氧氣存在的條件下，可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的過程中，會發(fā)出生物螢光(bioluminescence)。海腎螢光素酶是一種分子量約為36kD的蛋白，在氧氣存在的條件下，可以催化coelenterazine氧化成coelenteramide，在coelenterazine氧化的過程中也會發(fā)出生物螢光。生物螢光可以通過化學(xué)發(fā)光儀(luminometer)或液閃測定儀進行測定。本試劑盒的檢測原理參考圖1。

圖1. 雙螢光素酶的檢測原理圖。

??????通過螢光素酶和其底物這一生物發(fā)光體系，可以非常靈敏、高效地檢測基因的表達。通常把感興趣基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件或5’啟動子區(qū)克隆在luciferase的上游，或把3’-UTR區(qū)克隆在luciferase的下游等，構(gòu)建成報告基因(reporter gene)質(zhì)粒。然后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，用適當(dāng)藥物等處理細(xì)胞后裂解細(xì)胞，測定螢光素酶活性。通過螢光素酶活性的高低來判斷藥物處理等對目的基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。Renilla luciferase相對更多地被用作轉(zhuǎn)染效率的內(nèi)參，以消除細(xì)胞數(shù)量和轉(zhuǎn)染效率的差異。
??????螢火蟲螢光素酶催化luciferin發(fā)光的最強發(fā)光波長為560nm。海腎螢光素酶催化coelenterazine發(fā)光的最強發(fā)光波長為465nm。
??????本試劑盒可以測定1000個樣品。
包裝清單：

保存條件：
??????報告基因細(xì)胞裂解液和海腎螢光素酶檢測緩沖液在4℃保存1個月有效，-20℃保存一年有效，-80℃可以長期保存；螢光素酶檢測試劑和 海腎螢光素酶檢測底物(100×)在-20℃避光保存6個月有效，-80℃避光保存一年有效。
注意事項：
??????加入海腎螢光素酶檢測工作液后對于上一步驟中的螢火蟲螢光素酶的抑制可以達到99%以上。但總會殘留微量活性，因此，宜在轉(zhuǎn)染時把海腎螢光素酶的表達量控制在其RLU讀數(shù)高于螢火蟲螢光素酶RLU讀數(shù)的10%。海腎螢光素酶的讀數(shù)高于螢火蟲螢光素酶的讀數(shù)是完全可以的，通常不會有明顯的負(fù)面影響。
??????為取得測定效果，在用單管的化學(xué)發(fā)光儀測定時，樣品和測定試劑混合后到測定前的時間應(yīng)盡量控制在相同的時間內(nèi)，例如30秒內(nèi)；使用具有化學(xué)發(fā)光測定功能的多功能熒光酶標(biāo)儀時，宜先把樣品全部加好，然后統(tǒng)一加入螢火蟲螢光素酶檢測試劑。
??????由于溫度對酶反應(yīng)有影響，所以測定時樣品和試劑均需達到室溫后再進行測定。
??????為保證螢光素酶檢測試劑的穩(wěn)定性，可以采取適當(dāng)分裝后避光保存的方法，以避免反復(fù)凍融和長時
間暴露于室溫。經(jīng)測試，反復(fù)凍融三次，對測定結(jié)果無明顯影響。
??????樣品和測定試劑混合后，必須等待1-2秒，再進行測定。測定時間通常為10秒，根據(jù)情況也可以測定更長或更短時間，但是同一批樣品宜使用相同的測定時間。
??????RG027-4 海腎螢光素酶檢測底物(100×)配制在無水乙醇中。由于無水乙醇容易揮發(fā)，有時會在初次使用時發(fā)現(xiàn)體積明顯小于100μl的情況，此時用無水乙醇把體積補足至100μl，并混勻后即可使用。
??????海腎螢光素酶檢測工作液宜配制后立即使用。如不能立即使用，-20℃可以保存一周。隨著保存時間的延長檢測效果會不斷下降，因此不可配制成工作液后長期保存。
??????本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
??????為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。