MCF-7 / mRFP-EGFP-LC3穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株

質(zhì)粒來源：Addgene # 21074 ( 載體pEGFP-C1+mRFP；插入基因 Rat LC3B，GenBank ID: U05784 )

背景：自噬為機(jī)體在亞細(xì)胞水平的“自我吞噬”，可以幫助細(xì)胞維持自身穩(wěn)態(tài)及適應(yīng)應(yīng)激環(huán)境。近年來，自噬已成為生物學(xué)領(lǐng)域中的一個(gè)研究熱點(diǎn)。迄今研究發(fā)現(xiàn)，自噬可以參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，例如腫瘤，心血管疾病，神經(jīng)退行性疾病等。因而，自噬在各類相關(guān)疾病研究中作為藥物篩選靶點(diǎn)越來越受關(guān)注和討論。自噬研究的基礎(chǔ)是有效地觀察，定量細(xì)胞中自噬的發(fā)生。而目前應(yīng)用較為廣泛的自噬檢測(cè)方法為觀察GFP-LC3熒光斑，細(xì)胞正常生理環(huán)境LC3呈彌散狀分布，自噬激活時(shí)LC3會(huì)轉(zhuǎn)移至自噬囊泡上，因此，GFP熒光的彌散或斑點(diǎn)狀聚集可以比較準(zhǔn)確的反應(yīng)細(xì)胞狀態(tài)。

由于分子生物學(xué)的發(fā)展，現(xiàn)在已經(jīng)誕生了mRFP-GFP-LC3 雙熒光自噬指示體系，用于標(biāo)記及追蹤LC3以及自噬流的變化。其中GFP是酸敏感型GFP蛋白，而mRFP是穩(wěn)定的熒光表達(dá)基團(tuán)，不受外界影響。由于自噬小體進(jìn)入第二階段后，與溶酶體進(jìn)行融合，形成自噬溶酶體。自噬溶酶體由于溶酶體內(nèi)部的酸性環(huán)境，可以導(dǎo)致PH下降，GFP淬滅，因此，GFP的減弱可指示自噬溶酶體形成的順利程度，GFP越少，則從自噬小體到自噬溶酶體階段流通得越順暢。反之，自噬小體和溶酶體融合被抑制，自噬溶酶體進(jìn)程受阻。mRFP是一直穩(wěn)定表達(dá)的，因而可以通過GFP與mRFP的亮點(diǎn)比例來評(píng)價(jià)自噬流進(jìn)程。

優(yōu)點(diǎn)：mRFP-EGFP-LC3穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株可以穩(wěn)定持續(xù)的表達(dá)mRFP-EGFP-LC3，能夠有效地解決瞬轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)的效率低、周期長(zhǎng)、操作繁瑣、不穩(wěn)定等問題，有利于保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定性與可重復(fù)性。mRFP-GFP-LC3 雙熒光自噬指示體系的出現(xiàn)，把自噬研究帶入了一個(gè)新的階段，自噬不再只是指標(biāo)，而是一種機(jī)制，自噬流的順暢與否，對(duì)于細(xì)胞生理功能的穩(wěn)定非常關(guān)鍵。

培養(yǎng)條件：

置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中，用含10％胎牛血清（FBS; GIBCO）和1％雙抗（100 U/ ml青霉素和100 μg/ ml鏈霉素，GIBCO）的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)三天（密度大概80%）按照1：3的比例傳代。

維持壓力：puro 500ng/ml

亮點(diǎn)比例計(jì)算：image j軟件