SW1990-mCherry-luc胰腺癌細(xì)胞
- 細(xì)胞名稱 SW1990-mCherry-luc
- 組織 胰腺癌細(xì)胞系
- 母細(xì)胞來(lái)源 ATCC
- 轉(zhuǎn)染方法與標(biāo)記過(guò)程的描述 慢病毒轉(zhuǎn)染Hygromycin篩選
質(zhì)粒部分
1.酶切載體：pGL4.10（luc2）由酶切獲得1400bp的luc2基因片斷；mCherry片段由PCR擴(kuò)增獲得700-800bp左右片段；pSin-hyg-T2A載體酶切線性化。
2.電泳和膠回收：上述酶切產(chǎn)物DNA電泳，TAKARA試劑盒膠回收，回收產(chǎn)物取少量電泳鑒定。
3.連接載體與目的片段:使用Invitrogen T4連接酶連接luc2、mCherry片段和pSin-hyg-T2A線性化載體，連接使用20ul體系，25℃，10min。
4.轉(zhuǎn)化：感受態(tài)菌One Shot Stbl3在冰上融化后，加入連接產(chǎn)物，靜置25min后在水浴42℃，45sec熱休克，后加入250ul無(wú)抗培養(yǎng)基225轉(zhuǎn)搖菌1h，將轉(zhuǎn)化的菌鋪于有氨芐抗性平板37度過(guò)夜。
5.挑取單克?。河^察平板后挑取15個(gè)單克隆至含2ml氨芐抗性 LB培養(yǎng)基搖菌管中，255轉(zhuǎn)搖菌6.5h。
6.小抽質(zhì)粒與鑒定：使用堿裂解法小抽，質(zhì)粒用25ul含RNA酶ddH2O溶解；酶切鑒定: 重組質(zhì)粒用通過(guò)酶切鑒定。
7.熒光素表達(dá)鑒定: 重組質(zhì)粒pSin-hyg-mCherry/luc2（以下簡(jiǎn)稱Mluc） 轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞：DNA定量后，使用PEI轉(zhuǎn)染Mluc至24孔板已預(yù)鋪的293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染，試劑采用JetPEI (Polyplus公司)。兩管EP管中分別加入50ul生理鹽水，其中一管加入1ug量的質(zhì)粒（DNA體積=1ug/DNA濃度），輕輕震蕩混勻，再輕微離心；在另一管中加入PEI 2ul輕輕震蕩混勻，輕微離心，然后把PEI管中的溶液加入含有的質(zhì)粒管中，室溫孵育20min。將脂質(zhì)體包繞DNA的混合液加入需要轉(zhuǎn)染的24孔內(nèi)，37 ℃、5 % CO2條件下培養(yǎng)，8小時(shí)后換培養(yǎng)液。
8.報(bào)告基因檢測(cè)：Passive Lysis Agent裂解細(xì)胞，加入熒光素酶作用底物，將轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞與陰性，陽(yáng)性對(duì)照共同進(jìn)行單報(bào)告基因檢測(cè)。
9.質(zhì)粒中抽：取1ml轉(zhuǎn)染報(bào)告基因檢測(cè)正確的菌液加入100ml氨芐抗性的LB培養(yǎng)基中搖菌過(guò)夜，使用Invitrogen試劑盒中抽，產(chǎn)物電泳鑒定，－20℃保存。
慢病毒包裝部分
1. 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞：轉(zhuǎn)染前一天， 293T在10cm培養(yǎng)盤中的細(xì)胞達(dá)到90％，胰酶消化后，1：3傳入新10cm培養(yǎng)盤中。轉(zhuǎn)染時(shí)，細(xì)胞在培養(yǎng)盤中密度達(dá)到80％。采用脂質(zhì)體PEI轉(zhuǎn)染法使編碼慢病毒包膜蛋白的質(zhì)粒VSV G, Packaging Mix以及構(gòu)建的Mluc質(zhì)粒15µg共轉(zhuǎn)染。6h后換新鮮高糖DMEM培養(yǎng)基。
2．提取病毒上清：轉(zhuǎn)染48-72hours后，將含有病毒液的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到15ml離心管中,在低溫4攝氏度條件下，3000rpm，離心10min去除片狀沉淀的細(xì)胞碎片。
3．濃縮病毒：將病毒上清用0.45um濾器過(guò)濾至濃縮離心管中，2000rpm，4℃，15min離心。濃縮液收集于500µl離心管中，-80℃保存。
慢病毒感染&篩選
1.感染前一天(Day1)，消化SW1990細(xì)胞并計(jì)數(shù)，將細(xì)胞鋪于24孔板中（以便在感染前細(xì)胞達(dá)到30%-50%的匯合度），37°C過(guò)夜孵化細(xì)胞。
2.(Day2) 解凍低溫保存的慢病毒液，并且制備1：2病毒稀釋液200µl加入細(xì)胞中。
3.向每孔加入Polybrene達(dá)到終濃度6ug/ml，晃勻孔板，37度孵化過(guò)夜。
4.(Day3)移去含有慢病毒的培養(yǎng)基，加入500µl完全培養(yǎng)基。
5.(Day4)換液，加入300µg/ml Hygromycin（Sigma）來(lái)選擇穩(wěn)定感染的細(xì)胞克隆。
6.(Day4－7），每24h換液，300µg/ml Hygromycin（Sigma）來(lái)選擇穩(wěn)定感染的細(xì)胞克隆。
維持培養(yǎng)。
7.(Day8－12）細(xì)胞逐漸由24孔板傳入6孔板、6cm盤和10cm盤中100µg/ml Hygromycin維持培養(yǎng)。
8. SW1990-Mluc細(xì)胞系鑒定: 取5×104細(xì)胞，用Passive Lysis裂解液裂解，加入熒光素酶作用底物，將轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞與陰性，陽(yáng)性對(duì)照共同進(jìn)行單報(bào)告基因檢測(cè)。mCherry表達(dá)通過(guò)熒光顯微鏡觀察。
- 培養(yǎng)條件 ：置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中，用含10％胎牛血清和1％雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)三天（密度大概80%）按照1：3的比例傳代。
- 細(xì)胞傳代所需時(shí)間：3天/代
- 篩選標(biāo)記維持壓力和選擇壓力：Hygromycin 100ug/ml 和300ug/ml 。
關(guān)鍵字： 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株；luc；活體成像；sw1990-luc
上?？七h(yuǎn)迪生物科技有限公司成立于2007年，致力于活體生物發(fā)光、熒光成像技術(shù)和醫(yī)學(xué)凍存技術(shù)在中國(guó)的推廣和應(yīng)用！目前在南京、杭州等地有10多家代理商。人民衛(wèi)生出版社2010年出版的《高等學(xué)校創(chuàng)新教材-醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)系列》之《組織學(xué)與胚胎學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》分冊(cè)首次將活體動(dòng)物體內(nèi)功能成像技術(shù)（該書第十一章）寫進(jìn)醫(yī)學(xué)院校教材，標(biāo)志著該技術(shù)在國(guó)內(nèi)的普及應(yīng)用又上新臺(tái)階！本公司創(chuàng)始人參與了第十一章 《活體動(dòng)物體內(nèi)功能成像技術(shù)》的編寫工作！本公司與交通大學(xué)第六人民醫(yī)院合作完成的 《活體生物發(fā)光成像技術(shù)及其在消化道研究領(lǐng)域中的應(yīng)用》一文發(fā)表在《胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志》2010年第四期，本項(xiàng)目由上海市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.04ZB14072) 資助。本公司與浙江大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院李繼承教授，李冬梅博士合作完成的《小動(dòng)物活體成像技術(shù)研究進(jìn)展》一文發(fā)表在《中國(guó)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)報(bào)》2009,28(6):916-921。? ? 我們經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的實(shí)驗(yàn)研究與反復(fù)驗(yàn)證，研發(fā)出一系列Livecyte?即用型細(xì)胞凍存液系列產(chǎn)品，能有效地提高常規(guī)細(xì)胞、原代細(xì)胞與干細(xì)胞的復(fù)蘇后存活率與活力。產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定可靠、使用方便，助力科研工作者擺脫程序繁瑣、操作復(fù)雜、容易污染的傳統(tǒng)凍存方法，專注于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。該系