鼠肺炎病毒探針?lè)晒舛縍T-PCR試劑盒Pneumonia Virus of Mice的特點(diǎn)
1. 即開(kāi)即用，用戶只需要提供樣品RNA模板。
2. 引物和探針經(jīng)過(guò)優(yōu)化，靈敏性高。
3. 提供陽(yáng)性對(duì)照，便于區(qū)分假陰性樣品。
4. 特異性高，不會(huì)跟其他病毒的RNA發(fā)生交叉反應(yīng)。
5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針?lè)晒舛?RT-PCR 反應(yīng)。
6. 本產(chǎn)品只能用于科研。
包裝規(guī)格及成份（具體信息詳見(jiàn)説明書(shū)，以説明書(shū)為準(zhǔn)）
| 成份 | 編號(hào) | 十孔盒包裝 |
| 探針?lè)?nbsp;qRT-PCR 緩沖液 | A | 500μL（黃蓋） |
| 探針?lè)?nbsp;qRT-PCR 酶混合液 | B | 100μL（紅蓋） |
| 熒光 PCR 專用模板稀釋液 | C | 1 mL（黃蓋） |
| 探針?lè)?nbsp;qRT-PCR引物混合液 | D | 100 μL（白蓋） |
| qRT-PCR 探針 | E | 50 μL（棕色管） |
| 探針?lè)?nbsp;qRT-PCR陽(yáng)性對(duì)照(1×10E8 拷貝/μL) | F | 50 μL（黃蓋） |
| 使用手冊(cè) | G | 一份 |
鼠肺炎病毒探針?lè)晒舛縍T-PCR試劑盒Pneumonia Virus of Mice使用方法
一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，
千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照，
只提供無(wú)傳染性的 DNA 片段作為陽(yáng)性對(duì)照。
1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 RT-PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。
3. 在 7 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
6.重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品 RNA 的制備
7. 如果有N個(gè)樣品，最好設(shè)置N+2個(gè)提取，多出的一個(gè)是PC（樣品制備陽(yáng)性對(duì)照），一個(gè)是 NC（樣品制備陰性對(duì)照）?？梢杂?0μL陽(yáng)性對(duì)照的10000倍稀釋
液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。
8. 用自選方法純化樣品的RNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)病毒RNA提取試劑盒兼容。也以選購(gòu)本公司的柱式病毒RNAout。本試劑盒免費(fèi)贈(zèng)送20次免RNA提取
的核酸釋放劑試用裝，該釋放劑的裂解液可以直接作為RT-PCR模板，省略了RNA提取步驟。
三、Probe qRT-PCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）
9. 如果做定量分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個(gè)PCR 管，其中N+2個(gè)用于上步得到的 N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照（用水做模板），6個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。
如果做定性分析，并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+4 個(gè)PCR管，
其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模板），
1個(gè)用于PCR陽(yáng)性對(duì)照（用第4號(hào)管的陽(yáng)性對(duì)照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
10. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，并且陽(yáng)性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存
好后最后加）：
| 成分 | 樣品管N+2個(gè) | RT-PCR陰性對(duì)照管 | 標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品管
（2-7 管） |
| 探針?lè)╭PCR緩沖液 | 各 10 μL | 10 μL | 各 10 μL |
| 探針?lè)?nbsp;qPCR 酶混合液 | 各 2 μL | 2 μL | 各 2 μL |
| qRT-PCR探針 | 各 1 μL | 1 μL | 各 1 μL |
探針qRT-PCR
引物混合液 | 各 2 μL | 2 μL | 各 2 μL |
| 待測(cè)樣品 RNA 模板 | 各 5 μL | -- | -- |
| 超純水 | -- | 5 μL | -- |
| 第 7 步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液（2-7 號(hào)） | -- | -- | 各5 μL（2號(hào)樣到2號(hào)管，3號(hào)樣到3 號(hào)管…） |
蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行 qRT-PCR：
| 過(guò)程 | 溫度 | 時(shí)間 |
| 逆轉(zhuǎn)錄 | 50℃ | 30 min |
| 預(yù)變性 | 94℃ | 10 min |
| qRT-PCR 反應(yīng)（40 個(gè)循環(huán)） | 94℃ | 15 sec |
| 60℃ | 1 min（采集 FAM 通道的熒光信號(hào)）
|
四、數(shù)據(jù)處理
11.如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽(yáng)性對(duì)照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品核酸濃度的log值，再推算出其濃度。
12.如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽(yáng)性或陰性，則陰性對(duì)照Ct必須大于或等于40。陽(yáng)性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于39。對(duì)待測(cè)樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于39則為陽(yáng)性。如果在39-40之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽(yáng)性。
鼠肺炎病毒探針?lè)晒舛縍T-PCR試劑盒Pneumonia Virus of Mice【儲(chǔ)存條件及有效期】
-20℃±5℃，避光保存
有效期 12 個(gè)月。
鼠肺炎病毒探針?lè)晒舛縍T-PCR試劑盒Pneumonia Virus of Mice注意事項(xiàng)
1操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；
2試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，完全混勻并短暫離心；
3反應(yīng)液應(yīng)避光保存；
4反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；
5使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服；
6樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行，以免交叉污染；
7實(shí)驗(yàn)完畢后用10%次氯酸或75%酒精或紫外燈處理工作臺(tái)和移液器；
8試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對(duì)待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通則》進(jìn)行處理。
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