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本品產(chǎn)僅供科研

產(chǎn)品名稱(chēng)：隱襲腐霉染料法熒光定量PCR試劑盒Pythium insidiosum

產(chǎn)品規(guī)格：50次/盒

本產(chǎn)品是以染料法熒光定量PCR技術(shù)為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)的PCR試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：

1.即開(kāi)即用，用戶(hù)只需要提供樣品DNA模板。

2.引物等組分經(jīng)過(guò)優(yōu)化，靈敏度高。

3.提供陽(yáng)性對(duì)照，便于區(qū)分假陰性樣品。

4.特異性高，引物是根據(jù)高度保守區(qū)設(shè)計(jì)，不會(huì)跟其他的DNA/RNA發(fā)生交叉反應(yīng)。

5.既可用于定性檢測(cè)，又可用于定量檢測(cè)。用于定量檢測(cè)時(shí)線(xiàn)性范圍至少為5個(gè)數(shù)量級(jí)。

6.本產(chǎn)品足夠50次20μL體系的染料法熒光定量PCR反應(yīng)。

7. 本產(chǎn)品只能用于科研

隱襲腐霉染料法熒光定量PCR試劑盒Pythium insidiosum操作方法一、制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)樣品（以10E2-10E7拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度為例）。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，

千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照，

只提供無(wú)傳染性的DNA片段作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.標(biāo)記6個(gè)離心管，分別為7，6，5，4，3，2。

2.用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專(zhuān)用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。

3.在7號(hào)管中加入5 μL 陽(yáng)性對(duì)照（其濃度為1×10E8拷貝/μL，試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)樣品。放冰上待用。

4.換槍頭，在6號(hào)管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)樣品。放冰上待用。

5.換槍頭，在5號(hào)管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)樣品。放冰上待用。

6.重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)樣品。放冰上待用。

二、樣品DNA的制備

1.用自選方法純化樣品的DNA，本產(chǎn)品跟市場(chǎng)上絕大多數(shù)核酸純化產(chǎn)品兼容。

2.如果有N個(gè)樣品，則需要進(jìn)行N+2個(gè)樣品提取，多出的一個(gè)用作樣品制備陽(yáng)性對(duì)照管、另一個(gè)用作樣品制備陰性對(duì)照管。

三、設(shè)置qPCR反應(yīng)（20μL體系，在樣品制備室進(jìn)行）

如果進(jìn)行定量分析，則標(biāo)記N+9個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照，6個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)樣品。

如果做定性分析，則6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)樣品只選一個(gè)做（可以選4號(hào)，其余樣品不變）。以下只介紹定量分析的反應(yīng)設(shè)置。

四、數(shù)據(jù)處理

1.通過(guò)溶解曲線(xiàn)分析的結(jié)果排除無(wú)效數(shù)據(jù)。有Ct值，但Tm值跟陽(yáng)性對(duì)照Tm不一樣的樣品(包括對(duì)照和待測(cè)樣品)，歸為假陽(yáng)性，數(shù)據(jù)無(wú)效，不予以分析。Tm跟陽(yáng)性對(duì)照Tm一致的，為有效Ct。

2.如果兩種陰性對(duì)照的溶解曲線(xiàn)所得Tm值跟陽(yáng)性對(duì)照的Tm值一樣，說(shuō)明環(huán)境或試劑可能有過(guò)去的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染，則此次實(shí)驗(yàn)無(wú)效，需要解決污染問(wèn)題再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3.如果兩種陰性對(duì)照(樣品制備陰性對(duì)照和PCR陰性對(duì)照)是假陽(yáng)性，可以繼續(xù)分析其它樣品有效數(shù)據(jù)。

4.對(duì)定量檢測(cè)，以陽(yáng)性對(duì)照樣品的濃度的log值為橫軸，以有效Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。再以待測(cè)樣品的有效Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上推算出樣品DNA濃度的log值，再換算出待測(cè)樣品的DNA濃度。

5.對(duì)定性檢測(cè)，則有有效Ct值的為陽(yáng)性，無(wú)有效Ct值的為陰性。

隱襲腐霉染料法熒光定量PCR試劑盒Pythium insidiosum樣本采集、存放及運(yùn)輸：

1、樣本采集：各類(lèi)型樣本按照常規(guī)方法采集；

2、運(yùn)輸及保存：低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限一年。陽(yáng)性對(duì)照需單獨(dú)放置，不要污染其他試劑。

3、運(yùn)輸：采用泡沫箱加冰密封進(jìn)行運(yùn)輸。

4、自備試劑：樣品DNA。

隱襲腐霉染料法熒光定量PCR試劑盒Pythium insidiosum注意事項(xiàng)

1所有操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行

2試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，混勻并短暫離心；

3 反應(yīng)液應(yīng)避光保存；

4反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

5使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專(zhuān)用工作服；

6 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行，以免交叉污染；

7 實(shí)驗(yàn)完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺(tái)和移液器；

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