產(chǎn)品名稱：松材線蟲染料法熒光定量PCR試劑盒

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本產(chǎn)品是以染料法熒光定量PCR技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的PCR試劑盒，它具有下列特點：

1.即開即用，用戶只需要提供樣品DNA模板。

2.引物等組分經(jīng)過優(yōu)化，靈敏度高。

3.提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。

4.特異性高，引物是根據(jù)高度保守區(qū)設(shè)計，不會跟其他的DNA/RNA發(fā)生交叉反應。

5.既可用于定性檢測，又可用于定量檢測。用于定量檢測時線性范圍至少為5個數(shù)量級。

6.本產(chǎn)品足夠50次20μL體系的染料法熒光定量PCR反應。

松材線蟲染料法熒光定量PCR試劑盒操作方法

一、制備標準曲線樣品（以10E2-10E7拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例）。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的DNA片段作為陽性對照。

1.標記6個離心管，分別為7，6，5，4，3，2。

2.用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。

3.在7號管中加入5 μL 陽性對照（其濃度為1×10E8拷貝/μL，試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。

4.換槍頭，在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。

5.換槍頭，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。

6.重復上面的操作直到得到6個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品DNA的制備

1.用自選方法純化樣品的DNA，本產(chǎn)品跟市場上絕大多數(shù)核酸純化產(chǎn)品兼容。

2.如果有N個樣品，則需要進行N+2個樣品提取，多出的一個用作樣品制備陽性對照管、另一個用作樣品制備陰性對照管。

三、設(shè)置qPCR反應（20μL體系，在樣品制備室進行）

如果進行定量分析，則標記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照，6個用于標準曲線樣品。如果做定性分析，則6個標準曲線樣品只選一個做（可以選4號，其余樣品不變）。以下只介紹定量分析的反應設(shè)置。

【樣品要求】

1. 根據(jù)實際情況采樣，胃液分泌物、胃液嘔吐物以及樣品培養(yǎng)物作為檢測樣本，具體參考《臨床微生物樣本采集規(guī)范》。

2. 應避免樣本間交叉污染，樣本采集后應及時檢測，也可保存于-20±5℃待檢，長期保存應置于-70℃以下。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融少于 7 次，有效期 12 個月。

松材線蟲染料法熒光定量PCR試劑盒檢測方法的局限性

1樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關(guān)；

2 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；

3 陽性對照、擴增產(chǎn)物泄漏，會導致假陽性結(jié)果；

4 病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結(jié)果；

5 不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結(jié)果；

6 試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準確的結(jié)果；

7本檢測結(jié)果僅供參考，如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。

松材線蟲染料法熒光定量PCR試劑盒注意事項

1 所有操作嚴格按照說明書進行；

2 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應自然融化，完全混勻并短暫離心；

3 反應液應避光保存；

4反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

5 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服；

6樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行，以免交叉污染；

7實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

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