一、概要
   隨著中國水體的富營養(yǎng)化程度逐漸加劇，藍(lán)藻水華和赤潮的發(fā)生逐漸增加。80% 的藍(lán)藻水華都可以檢測出次生代謝產(chǎn)物---微囊藻毒素（microcystins，MCs），它對水體環(huán)境和人群健康的危害已成為全球關(guān)注的重大環(huán)境問題之一。微囊藻毒素為七肽單環(huán)肝毒素，結(jié)構(gòu)中存在著環(huán)狀結(jié)構(gòu)和間隔雙鍵，因而具有相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性，它能夠強(qiáng)烈抑制蛋白磷酸酶的活性，當(dāng)細(xì)胞破裂或衰老時(shí)毒素釋放進(jìn)入水中，同時(shí)它還是強(qiáng)烈的肝臟腫瘤促進(jìn)劑。MC是一種單環(huán)七肽物質(zhì)，具有明顯的肝細(xì)胞毒性。由于多肽中兩種可變氨基酸組成的不同，具有多種異構(gòu)體。其中存在最普遍、含量最多的是MC-LR，MC-RR，MC-YR這3種微囊藻毒素。研究表明，MC-LR的急性毒性最強(qiáng)，MC-YR次之，MC-RR最弱。

二、原理
  本試劑盒采用間接競爭法。酶標(biāo)板微孔中預(yù)包被微囊藻毒素抗原，樣品中殘留的微囊藻毒素與微孔板上的抗原競爭微囊藻毒素抗體，加入酶標(biāo)二抗后，用TMB顯色，吸光值與樣品中微囊藻毒素含量成負(fù)相關(guān)。

三、試劑盒組成

1. 包被有抗原的96微孔板：1塊（96 孔，12 條×8 孔）

2. 高濃度標(biāo)準(zhǔn)品100ng/mL：1 瓶× 1mL     

3. 標(biāo)準(zhǔn)品工作液：0、0.075、 0.225、 0.675、 2.0ng/mL                1 瓶× 1mL

4. 微囊藻毒素抗體： 1 瓶 × 8mL

5. 酶標(biāo)二抗：1 瓶 × 15mL

6. 10× 濃縮洗滌液：1 瓶 × 50mL

7. 樣本稀釋液：1 瓶 × 50mL

8. 顯色底物液（TMB）：1 瓶 ×17mL

9. 終止液：1 瓶 × 7mL

10. 試劑盒說明書

11. 質(zhì)檢報(bào)告                                      

四、需要的儀器、試劑
1）儀器   

1. 酶標(biāo)儀450nm（iELisa全自動(dòng)酶標(biāo)儀或相當(dāng)者）

2. 離心機(jī)

3. 微量移液器20μL～200μL，100μL～1000μL

4. 50mL離心管

5. 8道微量移液器

6. 酶標(biāo)板振蕩器

7. 天平：感量0.01g

五、樣品處理
1. 水樣品---飲用水、地表水

1. 直接吸取50μL澄清樣品用于檢測。

稀釋倍數(shù)：1
2. 海水

1. 吸取100μL澄清樣品與900μL樣本稀釋液，混勻；

2. 直接吸取50μL澄清樣品用于檢測。

稀釋倍數(shù)：5 （由于海水存在基質(zhì)效應(yīng)問題，根據(jù)大量的數(shù)據(jù)支撐，稀釋因子由10變更為5）

六、酶聯(lián)免疫分析程序
1. 測定之前注意事項(xiàng)
1) 使用前將所有試劑平衡至室溫（20-25℃）。
2) 使用后迅速將試劑放入2-8℃冷藏。
3) 在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序的要點(diǎn)。
4) 所有孵育過程應(yīng)避免陽光直射，并按要求用蓋板覆蓋住酶標(biāo)板。
2. 溶液的配制
1) 洗滌液的配制：將濃縮洗滌液用去離子水稀釋10倍后使用（1份濃縮洗滌液加9份蒸餾水）。
3. 測定程序
1) 將足夠標(biāo)準(zhǔn)品和樣品所用數(shù)量的孔條插入酶標(biāo)板架，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品做兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，記錄下標(biāo)準(zhǔn)和樣品的位置。未使用的酶標(biāo)板用鋁箔袋封好置2-8℃冷藏保存。
2) 分別吸取50μL 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品加至相應(yīng)的微孔（雙孔）中，然后各加入50μL微囊藻毒素抗體加蓋，室溫溫育30分鐘（每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)和樣品必須使用新的吸頭）。
3) 倒出孔中的液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍打以保證完全除去孔中的液體，然后每孔加入250μL 稀釋好的洗滌液洗滌，振蕩后倒出孔中的液體，拍干；重復(fù)操作四次，洗板時(shí)每次間隔30秒，洗完后用力在吸水紙上拍干。
4) 加入100μL酶標(biāo)二抗抗體加蓋，室溫溫育30分鐘（每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)和樣品必須使用新的吸頭）。
5) 倒出孔中的液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍打以保證完全除去孔中的液體，然后每孔加入250μL 稀釋好的洗滌液洗滌，振蕩后倒出孔中的液體，拍干；重復(fù)操作四次，洗板時(shí)每次間隔30秒，洗完后用力在吸水紙上拍干。
6) 每孔加入100μL底物， 室溫避光溫育10分鐘。
7) 每孔加入50μL終止液，混勻。
8) 置于酶標(biāo)儀中，振蕩混勻，在450nm處測定吸光度值（OD值），參比波長630nm。（iELisa全自動(dòng)酶標(biāo)儀可以直接讀出、打印濃度值）。
七、  結(jié)果判定
1. 所獲得的每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值（B₀）再乘以100%，即百分吸光度值。

以微囊藻毒素準(zhǔn)品濃度值（ppb）為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。相對應(yīng)每一個(gè)樣品的濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出。也可以用回歸方程法，計(jì)算出樣本溶液濃度。利用計(jì)算機(jī)專業(yè)軟件，更便于大量樣品的快速分析。
2. 樣品的實(shí)際濃度為讀數(shù)結(jié)果乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。
3. 如果測定值超出檢測范圍，樣品提取溶液按一定的比例用稀釋緩沖液進(jìn)行稀釋。
八、 注意事項(xiàng)
1. 室溫低于20℃或試劑及標(biāo)本未回到室溫（20- 25℃）會導(dǎo)致數(shù)值偏低。
2. 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥過久的情況，則會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
3. 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和顯色液對光敏感，避免直接暴露在光線下。
4. 混合要均勻，洗板要徹底（包括加樣品和標(biāo)準(zhǔn)液的時(shí)候都必需充分混合均勻）。
5. 反應(yīng)停止液為強(qiáng)酸性物質(zhì)，避免接觸皮膚。
6. 不要使用過了有效期的試劑盒，也不要稀釋或攙雜使用不同生產(chǎn)廠家的試劑盒這樣會引起靈敏度降低。
7. 試劑盒的儲存條件是2-8℃，切勿冷凍。
九、檢測方法靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度
1. 精密度:批內(nèi)變異系數(shù)<10%（n=10），批間變異系數(shù)<25%(n=10)。
2. 靈敏度：0.075ng/mL。
3. 樣本最低檢測線：
飲用水、地表水........................................0.075ng/mL
海水          ..........................................0.75ng/mL
4. 準(zhǔn)確度:
飲用水、地表水 .......................................90%±25%
海水 ........................................................ 90%±25%